Ein Assay zur Bestimmung der Initiation polymikrobieller Biofilme auf virusinfizierten Zellen

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Monoschichten von Säugetierzellen.

Saatguttest-Vertiefungen mit Herpes-simplex-Virus. In Kontrollbrunnen fehlt das Virus.

Das Virus bindet sich an Heparansulfat auf der Zelloberfläche und wird über Endozytose internalisiert.

Eine Virusinfektion löst die Heparanasekretion aus, die Heparansulfat spaltet und spezifische Pilzrezeptoren entlarvt.

Inkubieren Sie die Zellen gemeinsam mit Staphylococcus aureus und Candida albicans.

In virusinfizierten Zellen hemmt der Heparansulfat-Abbau die bakterielle Interaktion und fördert gleichzeitig die Interaktion mit Pilzrezeptoren, wodurch die Kolokalisierung von Bakterien und Pilzen verhindert wird.

In Kontrollzellen interagieren Bakterien mit Heparansulfat, während Pilze an verfügbare Rezeptoren binden.

Diese mikrobielle Co-Lokalisation initiiert die Adhärenz – den ersten Schritt bei der Biofilmbildung.

Entfernen Sie nach der Inkubation ungebundene Mikroben. Überlagern Sie es mit einem Lysepuffer, der Bakterien und Pilze an das Medium abgibt.

Verteilen Sie das Zelllysat auf Platten mit Wachstumsmedien. Für die Koloniebildung inkubieren.

Eine Abnahme der Bakterienkolonien mit einer entsprechenden Zunahme der Pilzkolonien deutet auf eine virusinduzierte Hemmung der bakteriell-pilzlichen Kolokalisation und der Biofilminitiierung hin.

Um einen polymikrobiellen Biofilm-Assay durchzuführen, säen Sie 96-Well-Platten mit 200 Mikrolitern von 2 mal 10 bis zum 5. HeLa-Zellen pro Milliliter. Schütteln Sie die Platten 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie 18 Stunden lang in 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie 1x optimal, um die Monolagen zu waschen. Säen Sie dann mit einem einzigen HSV-Stamm aus. Testen Sie jeweils nur einen Stamm.

Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die infizierten Monoschichten mit 100 Mikrolitern 37 Grad Celsius PBS mit Magnesium und Kalzium. Verwenden Sie dann 37 Grad Celsius HBSS, um das PBS zu ersetzen. Lassen Sie 25 Mikroliter des HBSS in jeder Vertiefung.

Als nächstes fügen Sie GT und/oder S. aureus-Arbeitssuspensionen hinzu und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation aspirieren Sie jeweils eine Säule der Platte. Füllen Sie die Vertiefungen sofort mit 300 Mikrolitern PBS mit Magnesium und Kalzium auf.

Nachdem Sie diesen Waschschritt zweimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter filtersterilisierten RIPA-Lysepuffer mit einer Verdünnung von 1 bis 50 in jede Vertiefung

.

Wenn Sie mit anderen Bakterien- oder Pilzstämmen arbeiten, stellen Sie sicher, dass die verwendete RIPA-Konzentration für die Zelllyse ausreichend, aber dennoch für mikrobielle Lebensfähigkeitstests zulässig ist.

Zerreiben Sie das HeLa-Zelllysat schnell und pipettieren Sie 50 Mikroliter auf Mannitolsalze und/oder fungizides Medium. Verteilen Sie dann mit einem in einem 90-Grad-Winkel gebogenen Glasstab das Lysat auf der Oberfläche der Platte.

Nachdem Sie die Platten 18 Stunden lang inkubiert haben, zählen Sie manuell die Anzahl der Kolonien pro Platte. Die Kontrollen bestehen aus S. aureus- und/oder C. albicans-Adhärenz an HSV-nicht infizierten HeLa-Zellen.