Warum ist die Bestimmung der MHK für die Validierung antifungaler Zielstrukturen wichtig?

Die Bestimmung der MHK (minimale Hemmkonzentration) ermittelt die niedrigste Konzentration, bei der eine Verbindung das sichtbare Wachstum von Pilzen hemmt, und liefert so eine quantitative Schwelle für die Wirkstoff-Wirkort-Interaktion. Dieser Parameter ermöglicht einen objektiven Vergleich der antifungalen Wirksamkeit verschiedener Substanzreihen. Sie unterstützt die Zielvalidierung, indem dosisabhängige Effekte in einem reproduzierbaren Format mit biologischer Aktivität verknüpft werden.

Wie ermöglicht die serielle Verdünnungsisolierung eine genaue Antimykotika-Screening-Analyse?

Die serielle Verdünnung erzeugt einen Konzentrationsgradienten, der eine präzise Bestimmung der hemmenden Schwellenwerte bei Testsubstanzen ermöglicht. Diese Methode isoliert die Variable der Substanzkonzentration, während der Pilzinokulum und die Inkubationsbedingungen konstant gehalten werden. Eine genaue Verdünnung gewährleistet eine zuverlässige MIC-Bestimmung, die entscheidend für die Reproduzierbarkeit des Screenings und die Bestätigung von Hits ist.

Was ermöglichen Trübungsmessungen bei der Interpretation von Antimykotika-Assays?

Turbiditätsmessungen zeigen das Pilzwachstum in den Kulturbrüchen an und dienen als direkter Nachweis der Vitalität in Gegenwart oder Abwesenheit von Testsubstanzen. Der Vergleich der Trübung in den Testbrüchen mit Leer- und Wachstumskontrollen ermöglicht eine visuelle Bestätigung der antimykotischen Wirkung. Diese quantitative oder semiquantitative Ausgabe erlaubt es den Arbeitsgruppen, das Wachstumshemmung auszuwerten und MIC-Werte zu berechnen.

Warum sind Anforderungen an die dreifache Durchführung von Tests für die Zusammenarbeit bei der Antimykotika-Screening wichtig?

Dreifache Tests gewährleisten die Datenzuverlässigkeit, indem sie die Variabilität zwischen den Wells verringern und konsistente antimykotische Wirkungen über die Replikate hinweg bestätigen. Diese Vorgehensweise unterstützt die interdisziplinäre Zusammenarbeit, indem sie reproduzierbare MHK-Werte bereitstellt, denen die Teams für Entdeckung, Screening und präklinische Untersuchungen vertrauen können. Konsistente Replikation minimiert Falsch-positiv-Ergebnisse und stärkt das Vertrauen in Entscheidungen zur Weiterverfolgung von Hits.

Welche statistische Analyse ist vor der Durchführung von Daten zur Antimykotika-Screening erforderlich?

Vor der Durchführung müssen die Teams die mittleren MIC-Werte und die Standardabweichung aus dreifachen Ansätzen berechnen, um die Datenvariabilität zu beurteilen. Schwellenwerte für eine signifikante Wachstumshemmung werden durch den Vergleich der Testansätze mit Wachstums- und Leerprobenkontrollen anhand visueller oder spektrophotometrischer Kriterien festgelegt. Diese Analyse stellt sicher, dass die beobachteten antimykotischen Effekte das Hintergrundrauschen übersteigen und für Entscheidungsprozesse geeignet sind.

Ein in vitro Bouillon-Mikrodilutionsassay für das Screening von antimykotischen Verbindungen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 3:48 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte und fügen Sie serielle Verdünnungen neuartiger antimikrobieller Peptide oder AMPs hinzu – die Testverbindungen.

Bestimmen Sie eine Teilmenge von Brunnen als Wachstumskontrollen und fügen Sie steriles Wasser ohne die AMPs hinzu.

Geben Sie einen pathogenen Pilz, der in Wachstumsmedien suspendiert ist, in ausgewählte Vertiefungen.

Fügen Sie nur die Medien ohne Pilz in eine Teilmenge von Vertiefungen ein, die als leere Steuerelemente gekennzeichnet sind.

Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie unter feuchten Bedingungen, die das Pilzwachstum begünstigen.

Beobachten Sie die Vertiefungen nach der Inkubation unter dem Mikroskop.

Die Wachstumskontrollen erscheinen aufgrund des Pilzwachstums in Abwesenheit von AMPs trüb. Die Trübung über alle Verdünnungen eines AMP zeigt seine Unwirksamkeit gegen den Pilz an.

Die leeren Steuerelemente, die frei von Pilzwachstum sind, erscheinen übersichtlich. Vergleichen Sie die Testvertiefungen mit den Blindkontrollen, um das Fehlen von Wachstum zu bestätigen, was auf die antimykotische Aktivität von AMPs hinweist.

Die niedrigste Konzentration eines AMP, die das Pilzwachstum hemmt, wird als minimale inhibitorische Konzentration oder MIC bezeichnet.

Der Antimykotikum-Assay wird in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Polystyrol-Mikroplatten unter Verwendung einer 2-fachen seriellen Verdünnung jedes Peptid- und Kontrollantimykotikums und eines Endvolumens von 50 Mikrolitern pro Vertiefung durchgeführt.

Der wichtigste Schritt im Protokoll sind die seriellen Verdünnungen. Seien Sie also in den nächsten Schritten sehr vorsichtig, um Fehler zu vermeiden, die Ihre gesamte Analyse beeinträchtigen

Mit einer Pipette 100 Mikroliter des Antimykotikums in der doppelten Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in den Spalten eins bis drei in Reihe A hinzufügen. Mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter steriles Wasser in die anderen Vertiefungen in den Reihen B bis H geben. 50 Mikroliter der Vertiefungen mit der höchsten Konzentration entfernen. In die entsprechenden Vertiefungen der nächsten Konzentration überführen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren homogenisieren.

Wiederholen Sie die serielle Verdünnung, bis die Vertiefungen mit der niedrigsten Konzentration erreicht sind, und entsorgen Sie 50 Mikroliter aus diesen Vertiefungen. Lassen Sie die Spalten 11 und 12 der Zeilen A, B und C nur mit Wasser für leere Kontrollen oder Kontrollen mit negativem Wachstum belassen. Geben Sie 50 Mikroliter des doppelt stark eingestellten Inokulums in RPMI1640 Medium in jede Vertiefung der Spalten 1 bis 3 plus Spalte 11.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026

Ein in vitro Bouillon-Mikrodilutionsassay für das Screening von antimykotischen Verbindungen

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