Ein ATP-Verwertungsassay zur Bestimmung des bakteriellen Überlebens unter Antibiotikabehandlung
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:56 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit der Aussaat einer Bakterienkultur in eine Assay-Platte. Inkubieren Sie dann die Platte.
Die Bakterienzellen haben Oberflächenadhäsine und Pili, die es ihnen ermöglichen, aneinander zu haften und kleine Aggregate zu bilden.
Geben Sie unterschiedliche Antibiotikakonzentrationen in die Vertiefungen, so dass eines für eine Kontrolle unbehandelt bleibt.
Die antibiotischen Moleküle interagieren mit empfindlichen Bakterien, beeinträchtigen deren Fähigkeit zu wachsen und sich zu vermehren, was zu ihrem Tod führt.
Die antibiotikaresistenten Bakterien bleiben metabolisch aktiv und produzieren ATP-Moleküle.
Verwenden Sie einen Ultraschallgerät, um die Bakterienzellen zu zerstören und ihren intrazellulären Inhalt, einschließlich ATP, freizusetzen.
Fügen Sie ein ATP-Verwertungs-Glühreagenz hinzu, das Luciferin, Luciferase-Enzym und andere Co-Faktoren enthält.
Luciferase nutzt ATP und Sauerstoff, um Luciferin in ein angeregtes Oxyluciferin umzuwandeln.
Das Oxyluciferin geht anschließend in seinen Grundzustand über und emittiert lumineszierendes Licht.
Messen Sie die Extinktion mit einem Plattenlesegerät.
Die Abnahme der Absorption bei höheren Antibiotikakonzentrationen deutet auf eine geringere ATP-Produktion hin, was auf eine verringerte bakterielle Überlebensrate hinweist.
Messen Sie die optische Dichte bei 650 Nanometern oder OD650, um die Konzentration der suspendierten Bakterien zu bestimmen, und stellen Sie die GC-Konzentration auf etwa 1 x 108 koloniebildende Einheiten pro Milliliter ein. Geben Sie als Nächstes 99 Mikroliter der GC-Suspension in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte und lassen Sie die Bakterien 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aggregieren.
Am Ende der Inkubation geben Sie 1 Mikroliter seriell verdünntes Ceftriaxon in jede Vertiefung, lassen Sie einige Vertiefungen unbehandelt, um als Kontrollen zu dienen, und stellen Sie die Platte für weitere 24 Stunden wieder in den Inkubator. Am nächsten Tag wird die Suspension in jeder Vertiefung dreimal bei 144 Watt und 20 Kilohertz für 5 Sekunden pro Ultraschall beschallt und 100 Mikroliter kommerziell erhältliches ATP-Verwertungs-Glühreagenz in jede Vertiefung gegeben
.Übertragen Sie vorsichtig 150 Mikroliter der Mischung aus jeder Vertiefung in einzelne Vertiefungen einer neuen schwarzen 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 560 Nanometern auf einem Plattenlesegerät. Berechnen Sie dann die Überlebensrate anhand des Verhältnisses des Messwerts, der nach einer seriellen Antibiotikabehandlung erhalten wurde, zu dem Messwert aus den unbehandelten Vertiefungen.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Auswirkungen unterschiedlicher Antibiotikakonzentrationen auf die Überlebensraten von Bakterien mithilfe der lumineszenzbasierenden ATP-Detektion. Die Methodik umfasst das Ansäen bakterieller Kulturen, deren Inkubation und die Messung der ATP-Produktion zur Beurteilung der Wirkung von Antibiotika.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Antibiotikaresistenz
- zellulärer Stoffwechsel
Hintergrund
- Bakterielle Zellen können durch Oberflächenadhäsine und Pili Aggregate bilden.
- Antibiotika interagieren mit empfindlichen Bakterien und beeinflussen deren Wachstum und Fortpflanzung.
- Die ATP-Produktion ist ein wichtiger Indikator für die bakterielle Stoffwechselaktivität.
- Mithilfe von Luciferase-basierten Assays lassen sich ATP-Spiegel durch Lumineszenz messen.
Zweck der Studie
- Die Überlebensraten von Bakterien unter verschiedenen antibiotischen Behandlungen zu bewerten.
- Die ATP-Detektion als Maß für die vitale Aktivität von Bakterien zu nutzen.
- Den Zusammenhang zwischen Antibiotika-Konzentration und dem metabolischen Aktivitätsniveau von Bakterien zu verstehen.
Verwendete Methoden
- Ansäen bakterieller Kulturen in Assay-Platten und Inkubation.
- Anwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Antibiotika und Messung der ATP-Konzentration.
- Verwendung eines Ultraschallzerreißers zur Zerstörung bakterieller Zellen und Freisetzung von ATP.
- Verwendung von Luciferin und Luciferase zur lumineszenzbasierenden ATP-Detektion.
Hauptergebnisse
- Höhere Antibiotikakonzentrationen führten zu einer verminderten ATP-Produktion.
- Niedrigere Absorptionswerte korrelierten mit reduzierten Überlebensraten der Bakterien.
- Die Bestimmung der optischen Dichte bestätigte die Anpassungen der Bakterienkonzentration.
- Kontrollansätze wiesen höhere ATP-Konzentrationen im Vergleich zu behandelten Ansätzen auf.
Schlussfolgerungen
- Die Antibiotikabehandlung beeinträchtigt die bakterielle Vitalität erheblich.
- Der Nachweis von ATP ist eine wirksame Methode zur Beurteilung des bakteriellen Überlebens.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann die Forschung zur Antibiotikaresistenz maßgeblich unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser auf ATP basierende Test liefert eine quantitative, lumineszenzbasierte Messung des bakteriellen Überlebens unter Antibiotikaeinfluss und ermöglicht so die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium der antimikrobiellen Wirkstoffentwicklung. Indem er die metabolische Aktivität mit der Wirkstoffeffizienz verknüpft, unterstützt er die mechanistische Risikominimierung und erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen. Die Methode ist direkt anwendbar auf Screening-Kampagnen, die auf bakterielle Pathogene abzielen, bei denen das Überleben mit der therapeutischen Wirkabsicht korreliert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst das Überleben von Bakterien als funktionellen Endpunkt für Targetbindung und Hemmung von Signalwegen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht eine schnelle, quantitative Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die mikrobielle Vitalität.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Risikominderung bezüglich des Targets, indem antibiotische Exposition mit dem metabolischen Output korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Dosis-Wirkungs-Daten anhand der Verringerung des ATP-Signals, um die Antibiotikapotenz zu quantifizieren.
- Operationaler Wert: Verwendet standardisierte Lyse und Reagenzzugabe für eine reproduzierbare, plattenbasierte Lumineszenzdetektion.
- Strategischer Wert: Ermöglicht skalierbare Substanzscreenings mit einem homogenen, waschfreien Nachweis, der mit Automatisierung kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsbezogenes System zur Bewertung der antimikrobiellen Aktivität bei klinisch relevanten Krankheitserregern wie Neisseria gonorrhoeae.
- Operationaler Wert: Liefert kontinuierliche, quantitative Überlebenskennzahlen, die eine Brücke zwischen in-vitro-Ergebnissen und präklinischen Entscheidungen schlagen.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Optimierung von Wirkstoffkandidaten, indem Verbindungen identifiziert werden, die eine anhaltende Unterdrückung der bakteriellen Stoffwechselaktivität aufweisen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Kontinuum der antimikrobiellen Wirkstoffentdeckung von der Zielvalidierung bis zur Leitsubstanzidentifizierung ein, wobei Überlebensmetriken die Priorisierung von Verbindungen vor präklinischen Wirksamkeitsstudien unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Prüft therapeutische Hypothesen, indem die ATP-Depletion als Indikator für bakteriellen Zelltod nach Antibiotika-Belastung gemessen wird.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Lumineszenzsignale, die eine Rangfolge der Wirkstoffpotenz über verschiedene Konzentrationen hinweg ermöglichen.
- Analytik: Berechnet Überlebensraten über das Verhältnis der Signale aus behandelten und unbehandelten Kontrollen und unterstützt damit die Bestimmung der IC50 sowie die Modellierung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen.
- Translationale Forschung: Verwendet Neisseria gonorrhoeae-Aggregate als klinisch relevante Modelle, um das Verhalten des Erregers in Infektionsnischen abzubilden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, reagentengestützte Plattform, die über verschiedene Bakterienspezies und Antibiotikaklassen hinweg für Screenings im gesamten Portfolio anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Behandlung mit einer Verbindung mit einem messbaren Verlust mikrobieller Stoffwechselaktivität verknüpft wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Robustheit des Assays durch standardisierte Zelllyse und Reaktionskinetik der Reagenzien und verringert so die Variabilität zwischen einzelnen Durchgängen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen auf der Grundlage von Überlebenskinetiken statt Endpunkt-CFU-Zählungen ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antimikrobiellen Wirkstoffkandidaten durch standardisierte, quantitative Profilierung der Überlebensfähigkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der mikrobiologischen Kulturpräparation und im Umgang mit Krankheitserregern unter Biosicherheitsbedingungen.
- Setzt den Zugang zu einem Luminometer oder Plattenreader voraus, der in der Lage ist, Absorption oder Fluoreszenz bei 560 nm zu detektieren.
- Erfordert die Standardisierung der bakteriellen Aggregation und der Inkubationszeiten, um eine konsistente ATP-Ausbeute über alle Vertiefungen hinweg sicherzustellen.
- Beinhaltet die Optimierung der Sonikationsparameter, um eine vollständige Lyse zu erreichen, ohne die Assay-Reagenzien zu schädigen.
- Auf metabolisch aktive Bakterien beschränkt; kann möglicherweise nicht zwischen vitalen, aber nicht kultivierbaren Zuständen und echtem Zelltod unterscheiden.
Biopharma-Häufige Fragen
Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026