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Immunologie
0 Aufrufe • 2:56 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit der Aussaat einer Bakterienkultur in eine Assay-Platte. Inkubieren Sie dann die Platte.
Die Bakterienzellen haben Oberflächenadhäsine und Pili, die es ihnen ermöglichen, aneinander zu haften und kleine Aggregate zu bilden.
Geben Sie unterschiedliche Antibiotikakonzentrationen in die Vertiefungen, so dass eines für eine Kontrolle unbehandelt bleibt.
Die antibiotischen Moleküle interagieren mit empfindlichen Bakterien, beeinträchtigen deren Fähigkeit zu wachsen und sich zu vermehren, was zu ihrem Tod führt.
Die antibiotikaresistenten Bakterien bleiben metabolisch aktiv und produzieren ATP-Moleküle.
Verwenden Sie einen Ultraschallgerät, um die Bakterienzellen zu zerstören und ihren intrazellulären Inhalt, einschließlich ATP, freizusetzen.
Fügen Sie ein ATP-Verwertungs-Glühreagenz hinzu, das Luciferin, Luciferase-Enzym und andere Co-Faktoren enthält.
Luciferase nutzt ATP und Sauerstoff, um Luciferin in ein angeregtes Oxyluciferin umzuwandeln.
Das Oxyluciferin geht anschließend in seinen Grundzustand über und emittiert lumineszierendes Licht.
Messen Sie die Extinktion mit einem Plattenlesegerät.
Die Abnahme der Absorption bei höheren Antibiotikakonzentrationen deutet auf eine geringere ATP-Produktion hin, was auf eine verringerte bakterielle Überlebensrate hinweist.
Messen Sie die optische Dichte bei 650 Nanometern oder OD650, um die Konzentration der suspendierten Bakterien zu bestimmen, und stellen Sie die GC-Konzentration auf etwa 1 x 108 koloniebildende Einheiten pro Milliliter ein. Geben Sie als Nächstes 99 Mikroliter der GC-Suspension in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte und lassen Sie die Bakterien 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aggregieren.
Am Ende der Inkubation geben Sie 1 Mikroliter seriell verdünntes Ceftriaxon in jede Vertiefung, lassen Sie einige Vertiefungen unbehandelt, um als Kontrollen zu dienen, und stellen Sie die Platte für weitere 24 Stunden wieder in den Inkubator. Am nächsten Tag wird die Suspension in jeder Vertiefung dreimal bei 144 Watt und 20 Kilohertz für 5 Sekunden pro Ultraschall beschallt und 100 Mikroliter kommerziell erhältliches ATP-Verwertungs-Glühreagenz in jede Vertiefung gegeben
.Übertragen Sie vorsichtig 150 Mikroliter der Mischung aus jeder Vertiefung in einzelne Vertiefungen einer neuen schwarzen 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 560 Nanometern auf einem Plattenlesegerät. Berechnen Sie dann die Überlebensrate anhand des Verhältnisses des Messwerts, der nach einer seriellen Antibiotikabehandlung erhalten wurde, zu dem Messwert aus den unbehandelten Vertiefungen.