Eine in vitro Flow-Untersuchung der Wirkung von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten

Nehmen wir vormontierte Strömungskammern, die mit Durchflusssystemen mit Transwell-Filtern verbunden sind: Eine mit einer endothelialen Monokultur oben, die andere mit einer Endothelkultur oben und Stromazellen unten.

Beide Kammern sind mit einem proinflammatorischen Zytokin vorbehandelt.

In einer Monokultur aktivieren Zytokine Endothelzellen und regulieren die Expression von Adhäsionsmolekülen hoch.

Die Wechselwirkung zwischen Stroma- und Endothelzellen in der Co-Kultur führt jedoch dazu, dass Stromazellen regulatorische Mediatoren produzieren, die die Reaktion der Endothelzellen auf entzündungsfördernde Zytokine herunterregulieren.

Positionieren Sie die Kammer auf einem inversen Phasenkontrast-Mikroskoptisch.

Führen Sie eine neutrophile Suspension ein.

Neutrophile werden rekrutiert und binden über transiente adhäsive Wechselwirkungen an die endothelialen Adhäsionsmoleküle, was ihre Interaktion mit oberflächengebundenen Chemokinen erleichtert und entlang des Endothels rollt.

Diese Interaktion aktiviert die Integrine auf den Neutrophilen, stabilisiert die Adhäsion und führt zu einer Transmigration durch die Endothelzellen.

In der Kokultur führt die herunterregulierte endotheliale Reaktion jedoch zu einer unterdrückten Rekrutierung von Neutrophilen.

Visualisieren Sie die Kulturen unter Phasenkontrastmikroskopie, um die Rekrutierung von Neutrophilen aus dem Fluss zu beurteilen.

Schneiden Sie für das Filtermodell zunächst ein Stück Parafilm mit einer Metallschablone auf die gleiche Größe wie das Glasdeckglas zu. Schneiden Sie dann mit einer Metallschablone einen 20 x 4 Millimeter großen Schlitz in den Parafilm aus, um den Strömungskanal zu erstellen. Verwenden Sie die Parafilm-Dichtung, um den Strömungskanal auf dem Glasabdeckglas zu markieren. Richten Sie die Ränder des Sechs-Well-Filters auf dem Glasabdeckglas aus. Stellen Sie sicher, dass der Filter die Markierungen der Strömungskanäle abdeckt. Schneiden Sie den Filter vorsichtig mit einem Skalpell vom Typ 10A aus.

Decken Sie anschließend den Filter vorsichtig mit einer Parafilm-Dichtung ab und stellen Sie sicher, dass sich der Strömungskanalschlitz in der Mitte des Filters befindet. Verwenden Sie ein Stück sauberes Taschentuch und drücken Sie alle Blasen heraus. Setzen Sie nun das Deckglas in die Aussparung der Bodenplatte der Plexiglas-Durchflusskammer ein.

Positionieren Sie die obere Plexiglasplatte über der Oberseite der Dichtung und schrauben Sie die Platten zusammen. Drehen Sie den Dreiwegehahn, damit der PBS-A-Waschpuffer durch das Ventil fließen kann. Verbinden Sie dann den Manometerschlauch mit der Einlassöffnung der oberen Plexiglasplatte. Führen Sie PBS-A durch den Strömungskanal, um Blasen passieren zu lassen.

Schließen Sie dann den Manometerschlauch von der Spritzenpumpe an die Auslassöffnung der Plexiglasplatte an. Reinigen Sie alle PBS-A-Platten, die auf die obere Platte der Kammer getropft sind. Stellen Sie schließlich die Kammer auf den Tisch eines inversen Phasenkontrastmikroskops und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Endothelzellen über den Filtern sichtbar werden.

Um Leukozyten über Endothelzellen zu perfundieren, stellen Sie die Spritzenpumpe auf Nachfüllung ein und drücken Sie Run. Nachdem der Fokus so eingestellt wurde, dass die Endothelzell-Monoschicht sichtbar ist, geben Sie zwei Milliliter gereinigter Neutrophilen in das Probenreservoir und lassen Sie es zwei Minuten lang erwärmen. Waschen Sie dann das Endothel zwei Minuten lang mit PBS-A. Schalten Sie das Ventil ein, um Neutrophile über dem Endothel zu perfundieren. Geben Sie den neutrophilen Bolus vier Minuten lang ab. Schalten Sie das Ventil aus und perfundierten Sie PBS-A für den Rest des Experiments aus dem Waschbehälter.

Achten Sie bei der Durchführung des Experiments darauf, dass zu keinem Zeitpunkt des Assays Luftblasen durchdringen, da dies die Monoschicht der Endothelzellen stört und zu einer Ablösung der adhärenten Neutrophilen führt.

Erfassen Sie die Rekrutierung von Neutrophilen entweder während des Neutrophilenflusses oder nach der Perfusion mit digitaler Bilderfassungssoftware. Identifizieren Sie die Mitte des Kanals, indem Sie das Objektiv an den Rand des Kanals an der Einlassöffnung bewegen und die Mitte der Öffnung identifizieren. Machen Sie alle digitalen Aufzeichnungen von mindestens 5 bis 10 Feldern in der Mitte des Strömungskanals.

Nehmen Sie während der Aufzeichnung während des Neutrophilenflusses eine Minute lang alle 10 Sekunden Bilder eines einzelnen Feldes auf. Bewegen Sie sich entlang des Kanals und nehmen Sie ein weiteres Feld für eine Minute auf, wobei Sie diesen Vorgang für die Dauer des Bolus wiederholen.

Um die Postperfusion aufzuzeichnen, machen Sie eine 10-Sekunden-Aufzeichnung von 5 bis 10 Feldern in der Mitte des Flusskanals, um das Verhalten der Leukozyten zu beurteilen. Nehmen Sie innerhalb des 10-Sekunden-Intervalls jede Sekunde Bilder auf. Dies gibt ausreichend Zeit für die Erfassung aus der Strömung und das Verhalten der adhärenten Neutrophilen, die analysiert werden sollen.

Nehmen Sie fünf Minuten lang ein einzelnes Feld mit mindestens 10 transmigrierten Neutrophilen auf und nehmen Sie alle 30 Sekunden Bilder auf. Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit von migrierten Zellen zu berechnen. Zeichnen Sie eine weitere Serie von 10-Sekunden-Feldern auf. Dies gibt den Neutrophilen Zeit, durch die endotheliale Monoschicht zu wandern.

Stoppen Sie abschließend die Spritzenpumpe und entfernen Sie den Auslassschlauch und dann den Einlassschlauch. Zerlegen Sie die Durchflusskammer und spülen Sie den Probenbehälter mit PBS-A. Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Filter und Objektträgerkanäle, bevor Sie mit der Analyse der Leukozytenrekrutierung und des Leukozytenverhaltens fortfahren, wie im Textprotokoll beschrieben.