Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Nehmen wir Krebszellen, die mit einem Chemotherapeutikum vorbehandelt wurden, das bei einem Prozentsatz der Zellen Seneszenz induziert.

Diese Zellen akkumulieren autofluoreszierende Lipofuszin-Granula, einen bekannten Seneszenzmarker.

Fügen Sie ein Antibiotikum hinzu, das in die Zellen eindringt und die lysosomalen Protonenpumpen hemmt, wodurch eine lysosomale Übersäuerung verhindert wird.

Eine Erhöhung des pH-Werts inaktiviert die lysosomalen Enzyme.

Seneszente Zellen exprimieren lysosomale β-Galactosidase selbst bei nahezu neutralem pH-Wert überexprimieren, was sie zu einem Seneszenz-Biomarker macht.

Führen Sie ein β-Galactosidase-Substrat ein. Ausbrüten.

β-Galactosidase hydrolysiert das internalisierte Substrat zu einem fluoreszierenden Produkt und markiert die seneszenten Zellen.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Füge einen Farbstoff für die Zellviabilität hinzu. In lebenden Zellen wandeln aktive Esterasen den Farbstoff in ein membranundurchlässiges fluoreszierendes Produkt um. Abgestorbene Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität bleiben ungefärbt.

Weisen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die lebensfähigen Zellen nach, die die dualen Marker Lipofuszin und f