Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Nehmen wir Krebszellen, die mit einem Chemotherapeutikum vorbehandelt wurden, das bei einem Prozentsatz der Zellen Seneszenz induziert.

Diese Zellen akkumulieren autofluoreszierende Lipofuszin-Granula, einen bekannten Seneszenzmarker.

Fügen Sie ein Antibiotikum hinzu, das in die Zellen eindringt und die lysosomalen Protonenpumpen hemmt, wodurch eine lysosomale Übersäuerung verhindert wird.

Eine Erhöhung des pH-Werts inaktiviert die lysosomalen Enzyme.

Seneszente Zellen exprimieren lysosomale β-Galactosidase selbst bei nahezu neutralem pH-Wert überexprimieren, was sie zu einem Seneszenz-Biomarker macht.

Führen Sie ein β-Galactosidase-Substrat ein. Ausbrüten.

β-Galactosidase hydrolysiert das internalisierte Substrat zu einem fluoreszierenden Produkt und markiert die seneszenten Zellen.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Füge einen Farbstoff für die Zellviabilität hinzu. In lebenden Zellen wandeln aktive Esterasen den Farbstoff in ein membranundurchlässiges fluoreszierendes Produkt um. Abgestorbene Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität bleiben ungefärbt.

Weisen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die lebensfähigen Zellen nach, die die dualen Marker Lipofuszin und fluoreszierendes β-Galactosidase-Substrat aufweisen, was auf seneszente Zellen hinweist.

Quantifizieren Sie den Prozentsatz der seneszenten Zellen, um die Wirksamkeit des Arzneimittels nachzuweisen.

Zuerst wird der lysosomale pH-Wert von kultivierten Zellproben eingestellt, indem eine Lösung von einem mikromolaren Bafilomycin A in DMEM in einer Konzentration von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter zu dem Zellpellet hinzugefügt und zum Mischen pipettiert wird. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator bei langsamer Geschwindigkeit. Um dann auf Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase zu färben, geben Sie DDAOG-Stammlösung in einer Menge von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu den Proben, ohne sie zu waschen.

60 Minuten lang vor direktem Licht geschützt auf einen Rotator stellen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen wie zuvor. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 0,5 % BSA in PBS. Geben Sie dann 300 Mikroliter verdünnte Calcinviolett-Lösung 450 AM zu den gewaschenen Zellpellets. 15 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.

Übertragen Sie die Zellproben in Röhrchen, die für Durchflusszytometriegeräte geeignet sind. Öffnen Sie in der Datenerfassungssoftware ein Histogramm für den violetten Kanal und ein Punktdiagramm für den dunkelroten Kanal im Vergleich zum grünen Kanal. Starten Sie die Zytometer-Datenerfassung bei niedriger Aufnahmegeschwindigkeit und platzieren Sie die mit DDAOG gefärbten Positivkontrollproben auf der Einlassöffnung. Beginnen Sie mit dem Erfassen von Beispieldaten. Passen Sie die Kanalspannungen so an, dass mehr als 90 % der Ereignisse in jedem Diagramm enthalten sind.

Wenn alle Einstellungen optimal sind, können Sie 10.000 Events pro Sample aufzeichnen. Legen Sie die mit DDAOG gefärbten Fahrzeugkontrollproben auf den Einlasskanal. Initiieren Sie die Datenerfassung und zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe auf. Achten Sie auf eine Zunahme der Autofluoreszenz oder des AF- und DDAO-Galactosid-Signals im Vergleich zur Positivkontrolle. Speichern Sie die Beispieldaten in . FCS-Dateiformat und exportieren Sie die Dateien auf einen Workstation-Computer, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware ausgestattet ist.