JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:37 Min. • July 8th, 2025
Behandeln Sie neuronale Kulturen mit steigenden Konzentrationen eines Testtoxins.
Das Toxin gelangt in die Zellen und wird in das Zytosol abgegeben.
Abhängig von seinem Potenzial kann das Toxin die vesikuläre Fusion verhindern und die Freisetzung von Neurotransmittern hemmen.
Ersetzen Sie das Medium durch einen Puffer, der spezifische neuropharmakologische Verbindungen enthält, um neuronale Aktionspotentiale zu blockieren.
Stellen Sie die Kulturschale auf eine elektrophysiologische Bühne. Um die Aufzeichnung zu starten, verbinden Sie ein Neuronen-Soma mit einer Pipette, die eine Aufnahmeelektrode enthält.
Üben Sie einen konstanten Unterdruck aus, um einen kleinen Membranteil anzusaugen, wodurch ein Gigaseal entsteht, eine dichte Abdichtung, die minimale Interferenzen während der Aufnahme gewährleistet.
Halten Sie eine konstante Membranspannung aufrecht, um neuronale Ströme zu messen.
Wenden Sie Unterdruckimpulse an, um die Membran zu durchbrechen, und stellen Sie einen direkten Kontakt zwischen dem Neuron und der Pipette her.
Zeichnen Sie die Ströme auf, die im Neuron aufgrund der Aufnahme von Neurotransmittern, den sogenannten mEPSCs, erzeugt werden.
Eine Abnahme der mEPSC-Häufigkeit mit erhöhter Toxinexposition deutet auf eine Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung hin.
Botulinum-Neurotoxin Serotyp A im ESN-Kulturmedium auf das 100-fache der gewünschten Endkonzentration verdünnen und auf 37 Grad Celsius erwärmen. Geben Sie dann eine angemessene Menge Toxin zu DIV 21+ ESN-Kulturen. Schwenken Sie die Kulturschale und kehren Sie zum Brutkasten zurück.
Aspirieren Sie das ESN-Kulturmedium zum gewünschten Zeitpunkt und waschen Sie es zweimal mit extrazellulärem Aufzeichnungspuffer oder ERB. Fügen Sie dann 4 Milliliter ERB hinzu, ergänzt mit 5 mikromolaren Tetrodotoxin, um die Aktionspotentiale zu blockieren, und 10 mikromolare Bicucullin, um die Aktivitätdes GABA-A-Rezeptors zu antagonisieren. Übertragen Sie als Nächstes die Schale in das Elektrophysiologie-Rig. Weder Perfusion noch Temperaturkontrolle sind für die gemessene Hemmung der synaptischen Transmission oder des MIST-Assays erforderlich.
Nachdem Sie Borosilikatpipetten mit einem Mikropipettenabzieher mit einem Widerstand von 5 bis 10 Megaohm gezogen haben, füllen Sie eine Pipette mit intrazellulärem Aufzeichnungspuffer auf. Tauchen Sie dann die Pipette vorsichtig in ein Silikonisierungsreagenz. Befestigen Sie die Aufzeichnungspipette auf dem Elektrodenhalter und befestigen Sie eine luftgefüllte Spritze an einem Schlauch, der in den Elektrodenhalter eingeführt wird. Sorgen Sie für einen gleichmäßigen Überdruck über die Spritze, während Sie die Aufnahmepipette in den ERB absenken.
Nachdem Sie die Aufzeichnungspipette vorsichtig auf dem Soma des aufzuzeichnenden Neurons gelandet haben, üben Sie den Überdruck aus, indem Sie das Siegel an der Spritze aufbrechen. Schließen Sie die Spritze wieder an und üben Sie durch sanftes Einatmen anhaltenden Unterdruck aus, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden. Sobald die Gigaohm-Dichtung gebildet ist, verringern Sie die Haltespannung auf minus 70 Millivolt und wenden Sie dann vorsichtig kurze Unterdruckimpulse mit der Spritze an, um in die Großhandelskonfiguration zu gelangen.
Überwachen Sie Kapazitätsspitzen 30 Sekunden lang, um zu bestätigen, dass der Patch stabil ist. Heben Sie die Kapazitätsspitzen in der Hacker-Software auf und wechseln Sie in den Stromklemmenmodus, um das Ruhepotenzial der Membran zu überwachen und aufzuzeichnen. Ohne Anpassung an die Potentiale der flüssigen Sperrschicht sollte das Potential der ruhenden Membran zwischen minus 67 und minus 82 Millivolt liegen.
Stellen Sie die Verstärkung auf 2 Millivolt pro Pikoampere ein. Wechseln Sie in den Voltage-Clamp-Modus und führen Sie eine kontinuierliche Minusspannung von minus 70 Millivolt durch, wobei Sie 3 bis 5 Minuten lang aufzeichnen, um postsynaptische Miniaturströme zu detektieren.
Analysieren Sie 3 bis 5 Minuten aufgezeichneter Daten, um MEPSCs mit den Standardeinstellungen für AMPA-Rezeptor-EPSCs in der Mini-Analyse zu erkennen. Sammeln und speichern Sie Informationen zu erkannten Ereignissen. Nach der Entnahme der mEPSC-Häufigkeiten für 8 bis 12 Kontrollen und 8 bis 12 mit Botulinum-Neurotoxin behandelte Proben für jede Expositionsbedingung analysieren Sie die Häufigkeit im Vergleich zu den alters- und chargenübereinstimmenden Kontrollen.