JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 3:22 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Röhrchen, das separate Vektoren für die Gene der schwerkettigen und leichtkettigen Antikörper enthält.
Fügen Sie ein Transfektionsreagenz hinzu, um mit den Vektoren Komplexe zu bilden.
Übertragen Sie diese Mischung auf Säugetier-Wirtszellen und inkubieren Sie zur Internalisierung.
Fügen Sie ein Anti-Klumpen-Mittel hinzu, um die gleichmäßige Verteilung der transfizierten Zellen zu fördern und die Zellregeneration und das Zellwachstum zu verbessern.
Fügen Sie eine antibakterielle und antimykotische Lösung hinzu, um eine Kontamination zu verhindern.
Innerhalb der Wirtszelle integrieren sich die Vektoren in das Wirtsgenom.
Nach der Gentranskription verlassen einzelne mRNAs den Zellkern und durchlaufen eine Translation, um entstehende Antikörperketten zu bilden.
Durch richtiges Falten und Modifizieren der entstehenden Ketten entstehen schwere und leichte Ketten.
Diese Ketten verbinden sich zu voll funktionsfähigen Antikörpern, die dann in das extrazelluläre Medium abgegeben werden.
Ernte das Medium und zentrifugiere es. Filtern Sie den Überstand.
Das Filtrat wird durch eine Reinigungssäule geleitet, die eine selektive Bindung der Antikörper ermöglicht.
Mit einem Elutionspuffer eluieren Sie die gereinigten Antikörper.
Züchten Sie CHO-Zellen in 200 Millilitern Medium zu langen Erlenmeyerkolben mit Blende. Kombinieren Sie 5 Milliliter CHO-Freestyle-Medium mit 50 Mikrogramm variabler schwerer Klon-DNA und 75 Mikrogramm variabler leichter Klon-DNA in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Wirbeln Sie dann das Rohr durch. Lassen Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 750 Mikroliter 1 Milligramm Polyethylenaminstock pro Milliliter in die DNA-Lösung und wirbeln Sie sie 30 Sekunden lang aggressiv ein.
Lassen Sie die Mischung weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie die gesamte Mischung in die CHO-Zellen, während Sie den Kolben manuell schütteln. Inkubieren Sie die Zellen sofort bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 130 U/min.
Geben Sie am nächsten Tag 2 Milliliter des 100-fachen Anti-Klumpens und 2 Milliliter der 100-fachen antibakteriellen Antimykotikum in die Zellen. Inkubieren Sie die Kolben bei 32 bis 34 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 130 U/min. Kultivieren Sie die Zellen 10 bis 11 Tage lang und fügen Sie jeden fünften Tag 10 Milliliter Trypton-N1-Futter und 2 Milliliter 100-faches Glutamin-Präparat hinzu. Zählen Sie die Zellen jeden dritten Tag, um sicherzustellen, dass die Zellviabilität über 80 % bleibt. Ernten Sie am 10. oder 11. Tag das Medium für die Antikörperreinigung, indem Sie die Kultur 40 bis 60 Minuten lang bei 3.000 g g und 4 Grad Celsius zentrifugieren. Filtern Sie dann das klare Medium mit einem 0,22-Mikrometer-Flaschenfilter.
Um die Antikörper aufzureinigen, äquilibrieren Sie die Protein-A-Säule mit zwei Säulenvolumina Bindungspuffer. Das gefilterte Medium wird mit einer Durchflussrate von 1 Milliliter pro Minute durch die Säule geleitet. Waschen Sie dann die Säule mit zwei Spaltenvolumina Bindepuffer. Verwenden Sie 5 Milliliter Elutionspuffer, um den Antikörper in 500-Mikroliter-Fraktionen zu eluieren.