JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:10 Min. • July 8th, 2025
Bereiten Sie eine Transfektionsmischung vor, indem Sie ein geeignetes kationisches Polymer und separate Plasmidvektoren für schwerkettige und leichtkettige Antikörpergene hinzufügen.
Das positiv geladene Polymer bindet sich an die negativ geladenen Plasmide und bildet Komplexe.
Geben Sie diese Transfektionsmischung in eine Multiwell-Platte, die menschliche embryonale Nierenzellkulturen in einem serumfreien Medium enthält, und inkubieren Sie.
Die Komplexe dringen durch Endozytose in die Zellen ein, verursachen eine endosomale Schwellung und Ruptur und geben sie an das Zytoplasma ab.
Das kationische Polymer erzeugt Poren in der Kernmembran, die den Eintritt in die Vektoren erleichtern und deren Transkription ermöglichen, gefolgt von der Translation in schwer- und leichtkettige Proteine.
Diese Proteine wandern in das endoplasmatische Retikulum, wo schwer- und leichtkettige Proteine dimerisiert und kovalent durch Disulfidbindungen verbunden werden, um Antikörper zu bilden.
Die Antikörper gelangen für zusätzliche posttranslationale Modifikationen in den Golgi-Apparat und werden zur extrazellulären Freisetzung in Vesikel verpackt.
Sammeln Sie das Medium mit den freigesetzten Antikörpern. Fügen Sie ein serumfreies Medium hinzu, um die Antikörperbildung fortzusetzen.
Bereiten Sie die HEK-Zellen in supplementiertem DMEM vor und züchten Sie sie in 75-Quadratzentimeter-Kulturflaschen auf 75 % Konfluenz. Bereiten Sie für jede Transfektion mit schweren/leichten Ketten eine Mischung mit 1,75 Millilitern DMEM ohne Serum vor. Fügen Sie 4,5 Mikrogramm Schwerkettenvektor, 3 Mikrogramm Leichtkettenvektor und 50 Mikroliter Polyethyleniminlösung hinzu. Geben Sie diese Mischung vorsichtig in eine Platte mit HEK-Zellen und schwenken Sie die Lösung über die Platte.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht und beginnen Sie dann, die Nährmedien jeden Tag zu sammeln und durch serumfreies Medium zu ersetzen. Das Medium enthält die Antikörper und kann vier Tage lang täglich entnommen werden.