Eine Hybridom-Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen eine Metallopeptidase

Nehmen Sie eine Maus, die mit einer Metallopeptidase immunisiert wurde. Ernten Sie die Milz und erhalten Sie eine Zellsuspension.

Filtern Sie die Suspension durch ein Netz und eine Zentrifuge, um Gewebeablagerungen zu entfernen.

Zu den isolierten Zellen gehören Metallopeptidase-spezifische B-Zellen, die Antikörper gegen Metallopeptidase-Epitope produzieren.

Fügen Sie unsterbliche Myelomzellen hinzu, denen das HGPRT-Enzym fehlt, um die Rettung von Nukleobasen für die Nukleotidsynthese zu verhindern. Sie überleben über die de novo Nukleotidsynthese.

Zentrifugieren, um ein Pellet zu erhalten, und den Überstand verwerfen.

Fügen Sie PEG hinzu und inkubieren Sie, wodurch eine Myelom-B-Zellfusion induziert wird, um HGPRT-positive immortale Hybridome zu bilden.

Fügen Sie HAT-Medium hinzu, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält. In Vertiefungen mit einer peritonealen Makrophagen-Feeder-Schicht überführen, die das Hybridomwachstum fördert.

Aminopterin blockiert die De-novo-Nukleotidsynthese, wodurch nicht fusionierte Myelomzellen absterben. Nicht fusionierte B-Zellen sterben aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer ab.

Die HGPRT-positiven Hybridome retten die Nukleotidvorläufer Hypoxanthin und Thymidin, proliferieren und sezernieren Metallopeptidase-spezifische monoklonale Antikörper.

Ernten Sie den Überstand, um die Antikörperproduktion über nachgeschaltete Assays zu bestätigen.

Zu Beginn injizieren Sie intraperitoneal 100 Mikrogramm APM-Protein in die ausgewählten erwachsenen weiblichen Mäuse, um einen abschließenden Antigen-Boost zu erhalten. Sammeln Sie nach 3 Tagen nach der Injektion die Milz von Mäusen und waschen Sie sie zweimal mit DMEM, um Blut- und Fettzellen zu entfernen.

Filtern Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Mesh-Kupfergitter, um Gewebeablagerungen zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen mittels Zentrifugation, um die Milzmembran zu entfernen. Aussaat der SP2/0-Myelomzellen der Maus in einem 25 Quadratzentimeter großen Kolben mit 5 Millilitern DMEM, ergänzt mit 6 % fötalem Rinderserum, und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxidatmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Nach 5 bis 6 Tagen Kultur sollten die Zellen nach der Wiederbelebung eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen und unter dem Mikroskop rund, hell und klar erscheinen. Sammeln Sie einen Tag vor der Hybridisierung Makrophagen aus den Bauchhöhlen der Mäuse.

Peritonealmakrophagen mit einer Dichte von 0,1 bis 0,2 mal 10 bis 10 pro Milliliter in 96-Well-Platten säen, die jeweils 100 Mikroliter HAT-Medium enthalten, und über Nacht inkubieren. Für die Hybridisierung werden SP2/0-Zellen mit einer Pipette von 8 bis 10 Flaschen schonend aspiriert und in 10 Millilitern serumfreiem DMEM-Medium resuspendiert.

Waschen Sie die Zellen mit frischem DMEM und zentrifugieren Sie sie zweimal, dann resuspendieren Sie sie in 10 Millilitern DMEM. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SP2/0-Zellen im Verhältnis 10 zu 1 und überführen Sie sie in 50-Milliliter-Röhrchen.

Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und sammeln Sie die Pellets am Boden der Röhrchen. Klopfen Sie auf das Rohr, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen. Geben Sie mit einer Pipette 1.500 auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Polyethylenglykol über einen Zeitraum von 45 Sekunden tropfenweise in das gelöste Zellpellet, während Sie den Boden des Röhrchens vorsichtig drehen.

Geben Sie dann langsam 1 Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes DMEM für 90 Sekunden zu der Mischung, gefolgt von weiteren 30 Millilitern frischem DMEM, und stellen Sie das Schmelzröhrchen für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Ernten Sie die Zellen nach der Inkubation. Resuspendieren Sie das HAT-Medium und kultivieren Sie es in einer 96-Well-Platte, die mit Peritonealmakrophagen inokuliert ist. Nach 5 Tagen 100 Mikroliter frisches HAT Medium in jede Vertiefung geben. Und auch hier gilt: Ersetzen Sie nach 5 Tagen Inkubation das Medium durch das HT-Medium. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit 5 Mikrogramm pro Milliliter APN-Protein beschichtet ist, verdünnt in 0,05 molaren PBS, um monoklonale Antikörper im Hybridom-Überstand mit einem ELISA-Assay zu analysieren.