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Immunologie
0 Aufrufe • 3:32 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Suspension von natürlichen Killerzellen oder NK-Zellen.
Monoklonale Anti-CD20-Antikörper hinzufügen und inkubieren.
In Abwesenheit von Zielkrebszellen, die das CD20-Antigen exprimieren, bindet die Fc-Region der Antikörper an die FcγRIIIa-Rezeptoren auf der NK-Zelloberfläche.
Nach der Inkubation gekühlte Medien hinzufügen. Zentrifugieren und ungebundene Antikörper entfernen.
Fügen Sie als Nächstes anti-humane κ-Leichtketten-Antikörper hinzu. Ausbrüten.
Diese Sekundärantikörper binden an die κ-Leichtkette der monoklonalen Antikörper.
Die Antikörpervernetzung ahmt die Bindung an das Zielantigen nach und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus.
Dies bewirkt eine künstliche Stimulation von NK-Zellen in Abwesenheit von Krebszellen.
Aktivierte NK-Zellen durchlaufen eine Umlagerung des Zytoskeletts und setzen zytotoxische Granulate frei.
Darüber hinaus produzieren die Zellen Chemokine und Zytokine.
Fügen Sie nach der gewünschten Dauer gekühlte Medien hinzu, um die Zellstimulation zu stoppen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen. Sammeln Sie den Überstand und das Zellpellet für die nachgelagerte Analyse der Antikörper-vermittelten Effektor-NK-Zellfunktionen.
GebenSie 100 Mikroliter resuspendierter natürlicher Killerzellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen oder eine 96-Well-U-Bodenplatte und legen Sie die Zellen auf Eis. Bereiten Sie Rituximab oder einen anderen Antikörper von Interesse in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter vor.
Geben Sie 1 Mikroliter in jedes Zellröhrchen für eine Endkonzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis. Während der Inkubation wird eine Lösung von Anti-Human-Kappa-Leichtketten-Antikörpern in Medien in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hergestellt. Die benötigte Menge an Antikörperlösung beträgt 50 Mikroliter pro Zellprobe.
Erwärmen Sie die Antikörperlösung auf einem Wärmeblock oder in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Wenn die Inkubation der Zellen abgeschlossen ist, geben Sie 1 Milliliter eiskaltes Medium in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 135 mal g und 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen erneut mit 1 Milliliter eiskaltem Medium. Aspirieren Sie den Überstand nach der letzten Wäsche und fügen Sie 50 Mikroliter der Anti-Human-Kappa-Leichtketten-Antikörperlösung hinzu, um die Zellen zu aktivieren. Legen Sie die Zellproben sofort bei 37 Grad Celsius auf einen Wärmeblock oder in ein Wasserbad und inkubieren Sie sie bis zu den gewünschten Zeitpunkten für die Analyse oder andere Verfahren.
Der beste Weg, um mehrere Proben zu handhaben, ist die Verwendung eines schwimmenden Gestells in einem 37-Grad-Wasserbad, das entfernt und auf Eis gelegt werden kann, um alle Reaktionen sofort zu stoppen.