JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:53 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir eukaryotische Expressionsvektoren, die entweder für eine Antikörper-Schwerkette oder eine Antikörper-Leichtkette kodieren, die von antigenspezifischen B-Zellen kloniert wurden.
Führen Sie Polyethylenimin ein, ein kationisches Polymer, das elektrostatisch mit den negativ geladenen Vektoren interagiert und Polyplexe bildet.
Inkubieren Sie Säugetierzellen mit den Polyplexen, die an den Zellen haften und über die Endozytose internalisiert werden. Die resultierenden Endosomen verschmelzen mit Lysosomen.
Die Polymere in den Polyplexen verursachen eine osmotische Schwellung des Vesikels, was zu dessen Bruch und Freisetzung der Vektoren führt.
Die freigesetzten Vektoren gelangen in den Zellkern und werden in schwer- und leichtkettige mRNA transkribiert, die über Ribosomen auf dem endoplasmatischen Retikulum transpliziert werden.
Die entstehenden Peptidketten lagern sich zu Antikörpern zusammen, die zum Golgi transportiert und in sekretorische Vesikel verpackt werden.
Bei der Fusion der sekretorischen Vesikel und der Zellmembran werden die Antikörper extrazellulär freigesetzt.
Ernten Sie den antikörperhaltigen Überstand für nachgeschaltete Assays.
Säen Sie einen Tag vor der Transfektion 15.000 humane embryonale Nierenzellen in 200 Mikrolitern Modifiziertem Eagle Medium von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid. Cotransfizieren Sie die Zellen mit einem linearen Transfektionsreagenz aus Polyethyleniminderivat. 0,5 Mikroliter DNA-Transfektionsreagenz mit 10 Mikrolitern 150 Millimolar Natriumchlorid verdünnen.
Als nächstes verdünnen Sie 0,125 Mikrogramm jedes variablen schweren und leichten kettenexprimierenden Vektors in 10 Mikrolitern 150 millimolar Natriumchlorid. Alle Verdünnungen jeweils 10 Sekunden lang vortexen. Mischen Sie dann das zuvor verdünnte DNA-Transfektionsreagenz mit 10 Mikrolitern DNA-Lösung. Die DNA-Transfektionsmischung 15 Sekunden lang schnell vortexen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Geben Sie die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen und schwenken Sie dann vorsichtig die Platte. Tauschen Sie das Medium 16 Stunden nach der Transfektion aus und kultivieren Sie die Zellen fünf Tage lang in serumfreiem Medium bei 37 Grad Celsius.