Ein Assay zum Nachweis von Autoantikörpern in humanem Serum unter Verwendung einer neuronalen Kultur aus dem Hippocampus

Nehmen wir den Rattenembryo hippocampi.

Fügen Sie Trypsin hinzu. Inkubieren, um den Abbau der Gewebematrix zu vermitteln und die Hippocampuszellen zu lockern.

Mit einem Puffer verdünnen. Inkubieren Sie für eine fortgesetzte enzymatische Verdauung mit Trypsin.

Übertragen Sie anschließend die Gewebemasse in ein mediumhaltiges Röhrchen. Wiederholtes Pipettieren zur mechanischen Dissoziation in einzelne Zellen.

Samenzellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern in Kulturplatten.

ausbrüten. Hippocampuszellen haften an den beschichteten Oberflächen. Die Neuronen entwickeln eine Lamelle und verlängern kleinere Neuriten.

Darüber hinaus wachsen die Neuriten mit axonalen und dendritischen Prozessen und bilden ein neuronales Netzwerk.

Reife Neuronen exprimieren synaptische exzitatorische Rezeptoren, N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren oder NMDARs.

Waschen Sie die Deckgläser nach der Inkubation mit Medien.

Fügen Sie ein verdünntes Serum für Patienten mit Autoimmunenzephalitis hinzu. Die Autoantikörper binden an neuronale NMDARs.

Mit Puffer waschen und dann die Zellen fixieren.

Fügen Sie fluorophormarkierte Sekundärantikörper hinzu, die an die NMDAR-gebundenen Autoantikörper binden.

Mit Puffer waschen. Legen Sie das Deckglas über Einbettmedien, die DAPI enthalten, um die Zellkerne zu färben.

Beobachten Sie mikroskopisch Fluoreszenzsignale auf Neuronen, die auf das Vorhandensein von Autoantikörpern im Serum hinweisen.

Für die enzymatische Dissoziation des Hippocampus bei 1 Milliliter 2,5% Trypsin in der 50-Milliliter-Tube, die die Hippocampi enthält, inkubieren Sie, nachdem Sie das Volumen in der Tube auf 5 Milliliter mit HBSS gebracht haben, die Tube für 15 Minuten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Um das Trypsin weiter zu verdünnen, fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes HBSS hinzu und stellen Sie das Röhrchen wieder für 5 Minuten in das auf 37 Grad Celsius eingestellte Wasserbad.

Verwenden Sie anschließend eine 1.000-Mikroliter-Mikropipette, um die Hippocampus, die als Schleimmasse erscheinen, in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, und inkubieren Sie das Gewebe 5 Minuten lang mit 6 Millilitern vorgewärmtem HBSS, wie gezeigt. Um das Gewebe mechanisch zu dissoziieren, überträgt man die Hippocampusmasse in ein 2-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden. Nach Zugabe von 1 Milliliter vorgewärmtem Medium homogenisieren Sie das Pellet mit einer 1.000-Mikroliter-Mikropipette, indem Sie es sanft auf und ab ansaugen.

Um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen, wiederholen Sie die Auf- und Ab-Aspiration 10 bis 20 Mal mit einer vorgezogenen Glaspipette, wobei die Spitze mit dem konischen Boden des Röhrchens in Kontakt kommt, bis die Mischung durchscheinend ist. Zählen Sie die Zellen, bevor Sie sie mit gekreuzten Schüttelbewegungen gleichmäßig auf einer 3,5 Zentimeter großen Schale verteilen. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Schale mit 5% Kohlendioxid in den Inkubator.

Für die fluoreszierende Immunfärbung von 14 Tage in-vitro-Zellen wird die Probe mit Anti-NMDAR-Antikörpern auf die Deckgläser gegeben und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach einer Stunde wird die Probe 5 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd in PBS als Fixierlösung bei Raumtemperatur behandelt. Waschen Sie dann die Probe dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS, gefolgt von der Zugabe des Sekundärantikörpers Ziegenanti-Human-Alexa Fluor 488 in einer Verdünnung von 1 bis 1.000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Montieren Sie anschließend die Deckgläser mit der Probe mit einem flüssigen Eindeckmedium und saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit ab.