Ein In-vitro-Assay zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf den Biofilm von Candida tropicalis

Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte, die den Pilz Candida tropicalis enthält.

Die Zellen sezernieren Sap2, ein proteolytisches Enzym, das ein Transmembran-Glykoprotein namens Msb2 spaltet und seine inhibitorische Domäne entfernt.

Dies führt dazu, dass der Pilz am Boden haftet und zu einer Mikrokolonie aus Hefe und fadenförmigen Formen heranwächst. Die Zellen sezernieren lösliche Bestandteile und Biopolymere und initiieren so die Bildung von Biofilmen.

Geben Sie eine Serumprobe mit Sap2-spezifischen Antikörpern in ausgewählte Vertiefungen und inkubieren Sie sie im Dunkeln.

Die Antikörper binden an Sap2 und neutralisieren dessen Aktivität, wodurch die Lebensfähigkeit der Zellen und die Reifung des Biofilms behindert werden.

In unbehandelten Vertiefungen reift der Biofilm zu einem dichten Netzwerk aus Zellen und extrazellulärer Matrix heran.

Saugen Sie die Flüssigkeit an, waschen Sie den Biofilm und trocknen Sie die Platte an der Luft. Fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln.

Lebensfähige Zellen, die membrangebundene Oxidoreduktasen verwenden, reduzieren das Substrat zu einem farbigen Produkt.

Übertragen Sie den farbigen Überstand und lesen Sie die Absorption ab.

Eine geringere Absorption in den serumbehandelten Vertiefungen deutet auf eine Antikörper-vermittelte Biofilmhemmung hin.

Bereiten Sie serielle Verdünnungen von hitzeinaktivierten Serumproben in sterilem RPMI1640 MOPS-Medium vor. Geben Sie 100 Mikroliter der ausgewählten Serumverdünnung in jede Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte.

In Spalte 10 wird nur RPMI1640-MOPS-Medium für die reine Pilz-Positivkontrolle zugegeben. Geben Sie eine Verdünnung des Serums von 1 bis 50 in alle Vertiefungen in Spalte 11, um als Negativkontrolle ohne Pilze plus Serum zu dienen. Nachdem Sie die Platte mit einem Deckel und Alufolie abgedeckt haben, inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag, nachdem Sie das Serum vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette abgesaugt haben, klopfen Sie vorsichtig auf die umgekehrte Platte, um alle Serumreste zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche dreimal und trocknen Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft, um überschüssiges PBS zu trocknen.

Lösen Sie dann 25 Milligramm XTT in 50 Millilitern filtersterilisiertem Ringer-Laktat auf. Aliquot 10 Milliliter in separaten Röhrchen. Decken Sie es mit Alufolie ab und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Als nächstes lösen Sie 8,6 Milligramm Menadion in 5 Millilitern Aceton auf und lagern Sie die Aliquots nach dem Verteilen von 50 Mikrolitern in 100 separaten Mikroröhrchen bei minus 80 Grad Celsius.

Nehmen Sie 10 Milliliter XTT und fügen Sie 1 Mikroliter Menadion hinzu, um eine 1-mikromolare Arbeitslösung zu erhalten. Fügen Sie 100 Mikroliter der XTT-Menadionlösung pro Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Nachdem Sie die Platte mit einem Deckel und Alufolie abgedeckt haben, inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Übertragen Sie schließlich 80 Mikroliter des farbigen Überstands aus jeder Vertiefung in eine frische 96-Well-Platte und lesen Sie die Platte bei 490 Nanometern ab.