Eine doppelt markierte Immunfluoreszenztechnik zur Visualisierung von Wirts- und Krankheitserregerproteinen in einer infizierten Zelle

Beginnen Sie mit fixierten und permeabilisierten Epithelzellen, die mit einem pathogenen Parasiten infiziert sind.

Fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Overlay mit polyklonalen Primärantikörpern der Maus, die spezifisch mit den Proteinen des Parasiten interagieren.

Fügen Sie dunkelrote Fluorophor-markierte Sekundärantikörper hinzu, die mit parasitären proteingebundenen Primärantikörpern interagieren.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Blockieren Sie mit Anti-Maus-Antikörpern, die an Primärantikörper binden und so die Kreuzreaktivität während der Wirtsproteinmarkierung minimieren.

Monoklonale Primärantikörper der Maus hinzufügen, die auf Ribonukleoproteine des Wirts in Epithelzellen abzielen.

Overlay mit einer Mischung aus grün fluorophor-markierten Sekundärantikörpern und rotem Fluorophor-konjugiertem Phalloidin, um die Markierung von Wirtsprotein-gebundenen Primärantikörpern bzw. Aktin zu erleichtern.

Mit einem Puffer waschen. Mit einem DNA-Flecken-haltigen Medium montieren, das dem Wirtskern, dem Parasitenkern und dem Kinetoplasten eine blaue Färbung verleiht.

Analysieren Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Die doppelt markierte Immunfluoreszenztechnik zeigt grüne Wirtsproteine und rote parasitäre Proteine, was ihre präzise subzelluläre Lokalisierung ermöglicht.

Geben Sie LLC-MK2-Zellen in 24-Well-Platten mit UV-sterilisierten, abgerundeten Deckgläsern und lassen Sie sie 16 Stunden lang ruhen. Um die Zellen zu infizieren, geben Sie dann einen Überstand, der T. cruzi enthält, in jede Vertiefung und inkubieren Sie sechs Stunden lang. Waschen Sie anschließend die Deckgläser mit den infizierten und nicht infizierten Zellen 5 Mal mit PBS.

Fixieren Sie dann die Zellen mit 2% Paraformaldehyd und PBS. Waschen Sie die Deckgläser nach 10 Minuten dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS und permeabilisieren Sie die Deckgläser dann 10 Minuten lang mit nichtionischem Reinigungsmittel.

Nach drei 5-minütigen PBS-Wäschen inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang in Blocklösung, gefolgt von einer weiteren 30-minütigen Inkubation mit einem monoklonalen oder polyklonalen Maus-Antikörper. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit Sekundärantikörpern in Blockierungslösung und Phalloidin, um Aktinfilamente in der Wirtszelle zu färben.

Waschen Sie dann die Deckgläser noch einmal dreimal mit PBS, bevor Sie eine kleine Menge Anti-Fade-Einbettreagenz mit DAPI-Medium auf die Oberfläche des Objektträgers auftragen. Kippen Sie das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig in das Medium, um Blasenbildung zu vermeiden.

Für die doppelte Markierung inkubieren Sie die Deckgläser und die Blockierungslösung, wie zuvor gezeigt, 30 Minuten lang in dem polyklonalen Maus-Antikörper. Waschen Sie anschließend die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang mit dem Sekundärantikörper inkubieren.

Führen Sie dann nach drei PBS-Waschungen einen zweiten Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG durch, das in einer Blockierungslösung verdünnt ist. Waschen Sie die Deckgläser nach 30 Minuten erneut mit PBS, bevor Sie sie weitere 30 Minuten lang mit dem monoklonalen Maus-Antikörper inkubieren.

Als nächstes, nach drei PBS-Wäschen, inkubieren Sie die Deckgläser mit Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-Antikörper und Phalloidin. Tragen Sie dann nach drei PBS-Wäschen das Anti-Fade-Eindeckreagenz auf, wie zuvor gezeigt.