Eine Immunfluoreszenz-Färbetechnik zum Nachweis der adulten Hippocampus-Neurogenese

Nehmen wir einen Hirnschnitt einer Maus, der aus dem Gyrus dentatus des Hippocampus besteht, einem Ort für die Neurogenese, der aus neuronalen Vorläuferzellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien besteht.

Übertragen Sie den Schnitt in eine Permeabilisierungs-blockierende Lösung. Detergensmoleküle in der Lösung permeabilisieren die Zellen, während die Proteine die unspezifischen Bindungsstellen blockieren.

Fügen Sie einen primären Antikörpercocktail hinzu, der auf spezifische Neurogenese-Marker abzielt, ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein und ein intermediäres Filamentprotein.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper. Führen Sie verschiedene Fluorophor-markierte Sekundärantikörper ein, die an die Primärantikörper binden.

Fügen Sie Serumproteine aus demselben Wirt hinzu, die wie einer der primären Antikörper stammen, und sättigen Sie die Paratope auf den sekundären Antikörpern.

Einführung monovalenter Fab-Fragmente, die die Epitope der Serumproteine sättigen und eine unspezifische Bindung verhindern.

Fügen Sie einen zweiten Primärantikörper hinzu, der mit demselben Wirt erhöht wurde und an ein anderes Zwischenfilamentprotein bindet.

Einführung von Fluorophor-markierten Sekundärantikörpern, die auf den zweiten Primärantikörper abzielen.

Identifizieren Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die neuronalen Vorläufer-Subtypen, die einzigartige Markerkombinationen exprimieren.

Beginnen Sie damit, die Abschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste aus der Frostschutzlösung auf TBS zu übertragen. Spülen Sie die Partien gründlich aus, beginnend mit einer Nachtwäsche bei 4 Grad Celsius, gefolgt von fünf 10-minütigen Wäschen bei Raumtemperatur. Alle diese Inkubationen sollten unter kontinuierlichem, sanftem Rühren durchgeführt werden.

Wenn eines der interessierenden Antigene ein Thymidin-Analogon ist, muss an dieser Stelle ein Salzsäure-Denaturierungsschritt durchgeführt werden, gefolgt von einem Neutralisationsschritt in Boratpuffer. Fahren Sie mit der Permeabilisierung und Blockierung der unspezifischen Antikörper-Bindungsstellen in TBS-plus fort. Lassen Sie diese Inkubation 1 Stunde bei Raumtemperatur laufen.

Dann inkubieren Sie den ersten Primärantikörper, der über Nacht bei 4 Grad Celsius in TBS-plus verdünnt wurde. Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte dreimal in TBS und einmal in TBS-T. Lassen Sie jedes Bad 10 Minuten lang gehen. Inkubieren Sie dann drei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper. Schützen Sie die Abschnitte ab sofort vor Lichteinwirkung.

Nach einer weiteren Waschserie werden die Schnitte in eine 10%ige Serumlösung der Wirtsspezies überführt, aus der die beiden Primärantikörper hergestellt wurden. Inkubieren Sie die Abschnitte drei Stunden lang in dieser Lösung, um die offenen Paratope auf dem ersten Sekundärantikörper zu sättigen. Spülen Sie später dreimal in TBS und einmal in TBS-T, um das Serum zu entfernen.

Bereiten Sie dann eine Lösung von TBS-plus mit 50 Mikrogramm pro Milliliter unkonjugierter monovalenter Fab-Fragmente vor, die gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers gerichtet sind. Damit werden die Epitope abgedeckt, die sonst vom zweiten Sekundärantikörper erkannt werden könnten. Übertragen Sie die Schnitte in diese Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Spülen Sie die Abschnitte nach der Inkubation mindestens dreimal in TBS und einmal in TBS-T. Tupfen Sie während des Transfers die Netzeinsätze mit den Abschnitten auf ein Papiertuch, um Reste von Fab-Resten zu entfernen. Inkubieren Sie nun die Abschnitte im zweiten Primärantikörper über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Nach einer weiteren Waschserie den zweiten Sekundärantikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur auftragen. Zum Schluss die Abschnitte dreimal in TBS waschen und mit dem Einbetten der Abschnitte in Gelatine fortfahren. Trocknen Sie die Objektträger an der Luft und decken Sie sie mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium ab.