JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:09 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie die Kryosektion einer Hautbiopsie von einem Parkinson-Patienten, der in einem Einbettungsmedium eingeschlossen ist.
Das Gewebe besteht aus einer äußersten Epidermis, einer darunter liegenden Dermis und subkutanem Fett, das von Nerven innerviert wird.
Waschen Sie den Abschnitt, um das Einbettmedium zu entfernen. Übertragen Sie es in eine Permeabilisierungs-Blockierungslösung, permeabilisieren Sie die Zellen und blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen.
Tauchen Sie den Schnitt in einen primären Antikörper-Cocktail, um eine gleichmäßige Antikörpermarkierung zu erzielen, die als Free-Floating-Färbung bezeichnet wird.
Die Antikörper dringen in die Neuronen ein und binden an Alpha-Synuclein-Aggregate, die entlang der Axone verteilt sind – eine aggregierte Form, die für neurodegenerative Erkrankungen charakteristisch ist – und an Carboxyl-terminale Hydrolasen.
Führen Sie Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper ein, die an die Primärantikörper binden.
Mit einem fluoreszierenden DNA-Bindungsfarbstoff behandeln, der den Zellkern färbt.
Legen Sie das Taschentuch auf einen Objektträger, tragen Sie ein Eindeckmedium auf und verschließen Sie es mit einem Deckglas.
Unter einem konfokalen Mikroskop zeigt die Fluoreszenz beider Antikörper das Vorhandensein von Alpha-Synuclein-Aggregaten entlang der Axone der dermalen Neuronen.
Füllen Sie zunächst einige der Vertiefungen einer frischen 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Waschlösung. Übertragen Sie die zu analysierenden Schnitte von der Speicherplatte auf die Platte mit der Waschlösung. Lassen Sie die Abschnitte 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Waschlösung. Übertragen Sie dann jeden Abschnitt in eine leere Vertiefung, die dieselbe Waschlösung enthält, und wiederholen Sie den Waschvorgang. Geben Sie dann eine Waschlösung zu den Abschnitten und geben Sie sie in neue Vertiefungen mit 100 Mikrolitern Blocklösung. Bei Raumtemperatur mindestens 90 Minuten und maximal 4 Stunden inkubieren.
Verdünnen Sie die primären Antikörper, Anti-PGP9.5 und Anti-5G4 in der Arbeitslösung. Die Schnitte werden in neue Vertiefungen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der Primärantikörper überführt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag wie zuvor beschrieben in Vertiefungen, die Waschlösung enthalten. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper - Ziegen-Anti-Kaninchen zum Nachweis von Anti-PGP9.5 und Ziegen-Anti-Maus zum Nachweis von 5G4 in der Arbeitslösung.
Die gewaschenen Abschnitte werden in neue Vertiefungen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der Sekundärantikörper überführt. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um ein Ausbleichen von Fluorophoren zu vermeiden, die mit Sekundärantikörpern konjugiert sind, und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Waschen Sie danach die Abschnitte wie zuvor beschrieben zweimal in Waschlösung. Übertragen Sie die gewaschenen Abschnitte für 5 Minuten bei Raumtemperatur in neue Vertiefungen mit 100 Mikrolitern DAPI. Waschen Sie die Abschnitte wie zuvor beschrieben zweimal in Waschlösung. Montieren Sie dann die Abschnitte in der richtigen Position auf einer Rutsche, um Fehlfalten zu vermeiden.
Geben Sie ein paar Tropfen Montagemedium auf die Folie und bedecken Sie den Abschnitt mit einem Deckglas. Lassen Sie die Dias über Nacht trocknen. Lagern Sie die Objektträger am nächsten Tag in einer geeigneten Schachtel bei 4 Grad Celsius und achten Sie darauf, Lichteinwirkung zu vermeiden.
Betrachten Sie die Schnitte mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop. Erfassen Sie die Bilder mit einer Kamera, die an das Mikroskop angeschlossen ist. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop, um positive Signale in Schnitten in Bezug auf die räumliche Verteilung und Intensität des Signals zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben.