Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Beginnen Sie mit einem funktionalisierten Glykochip mit gedruckten Glykan-Subarrays, die in Blöcken von Arrays organisiert sind.

Jeder Punkt im Subarray repräsentiert ein bestimmtes Glykan – ein Polymer auf Kohlenhydratbasis mit Variationen in der Monosaccharidzusammensetzung, der Kettenlänge und dem Verzweigungsmuster.

Behandeln Sie den Glykochip mit einem Blockierungspuffer, um unspezifische Interaktionsstellen zu blockieren.

Übertragen Sie den Glykochip und geben Sie verdünntes Mausserum in einen mit Tensiden angereicherten Puffer, um die Antikörperaggregation zu minimieren. Unter Rühren inkubieren.

Das Rühren fördert eine gleichmäßige Serumverteilung und erleichtert die selektive Bindung von Anti-Glykan-Antikörpern an spezifische Glykane auf der Grundlage unterschiedlicher molekularer Eigenschaften.

Mit abnehmenden Konzentrationen eines tensidhaltigen Puffers waschen, um die unspezifische Bindung zu stören, und spülen.

Überlagern Sie den Glykochip mit Anti-Maus-Biotin-konjugierten Sekundärantikörpern, interagieren Sie mit vorgebundenen Anti-Glykan-Antikörpern und waschen Sie.

Einführung von Fluorophor-markiertem Streptavidin, das an biotinylierte Sekundärantikörper bindet. Waschen und überschüssige Lösung entfernen.

Scannen Sie den Glykochip und suchen Sie nach eindeutigen Fluoreszenzflecken an verschiedenen Positionen, die auf Glykan-spezifische zirkulierende Antikörper im Serum hindeuten.

Bereiten Sie Puffer #1 bis Puffer #4 vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Glykochips und Proben vorzubereiten, stellen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Objektträgern auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur erreicht haben. Öffnen Sie die Box und geben Sie den Glykochip in die Inkubationskammer, die bereits mit nassem Filterpapier konditioniert sein sollte, um die Luftfeuchtigkeit in der Kammer konstant zu halten.

In der Zwischenzeit das Mäuseserum mit Puffer 1 in 1,5-Milliliter-Röhrchen verdünnen. Homogenisieren Sie die Serumlösung 5 Sekunden lang mit einem Vortex-Mischer. Nach der Homogenisierung das verdünnte Serum bei 37 Grad Celsius 10 Minuten lang in einem Wasserbad inkubieren, um eine Immunglobulinaggregation zu vermeiden. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen 3 Minuten lang bei 10.000 mal g und 25 Grad Celsius.

Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie das ausgefällte Material. Platzieren Sie den Glykochip vorsichtig in der Inkubationskammer. Inkubieren Sie es mit 1 Milliliter Puffer #3, um jegliches Restmaterial auf der Oberfläche des Glykochips zu entfernen. Halten Sie den Glykochip 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einer vertikalen Position und waschen Sie ihn mit einigen Tropfen Puffer #3 mit einer Pasteur-Plastikpipette erneut.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Puffer mit Filterpapier von der Glykochip-Oberfläche. Setzen Sie den Glykochip wieder in die Inkubationskammer ein. Verteilen Sie die verdünnte Serumprobe mit einer Mikropipette auf der Glykochip-Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle trockenen Bereiche der Glykochip-Oberfläche mit der Spitze der Pipette von der verdünnten Serumprobe bedeckt sind.

Inkubieren Sie unter orbitaler Bewegung bei 37 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation alle überschüssigen Proben und tauchen Sie den Glykochip 5 Minuten lang in Puffer #3 bei 25 Grad Celsius. Geben Sie den Glykochip in einen Behälter mit Puffer #4 und waschen Sie den Glykochip schließlich mit Reinstwasser.

Zentrifugieren Sie den Glykochip 1 Minute lang bei 175 mal g und 25 Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu entfernen. Nachdem Sie den Glykochip wieder in die Inkubationskammer gelegt haben, verteilen Sie eine Lösung aus Ziegen-Anti-Maus, die mit Biotin konjugiert ist, auf der Glykochip-Oberfläche. Eine Stunde lang unter orbitaler Bewegung bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie die ungebundene Fraktion und wiederholen Sie die Waschschritte.

Nach der Zentrifugation inkubieren Sie den Glykochip 45 Minuten lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln mit 2 Mikrogramm pro Milliliter der entsprechenden Fluorochrom-markierten Streptavidin-Lösung in Puffer #2. Nachdem Sie im Dunkeln gearbeitet haben, um die ungebundene Fraktion zu entfernen, und die Waschschritte wiederholt haben, trocknen Sie den Glykochip an der Luft.

Um das Array zu scannen, lassen Sie den Glykochip auf dem Tisch, bis er im Dunkeln Raumtemperatur erreicht. Schalten Sie gleichzeitig den Diascanner und den Laser ein. Halten Sie den Microarray fest und schieben Sie den Glykochip in den Schlitz, bis er die Rückseite berührt. Scannen Sie den Glykochip, indem Sie Easy Scan ausführen, und speichern Sie den Scan als .tiff Datei.