Immunlokalisation von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in pflanzlichem Gewebe

Nehmen Sie einen Objektträger mit Reaktionsvertiefungen, die Dünnschnitte verschiedener Pflanzengewebe enthalten. Das Gewebe wird fixiert und in ein Harz eingebettet, um die Immunfärbung zu ermöglichen.

Legen Sie den Objektträger in eine dunkle und feuchte Inkubationskammer, um Lichteinwirkung und Reagenzienverdunstung während der nachfolgenden Schritte zu verhindern.

Führen Sie eine Blockierungslösung ein, um unspezifische Antikörperinteraktionen zu verhindern.

Waschen, um überschüssige Blockierungslösung zu entfernen, dann antigenspezifische Primärantikörper hinzufügen und inkubieren.

Die Antikörper binden an ihre Zielantigene, nämlich Arabinogalactan-Proteine und Pektine in der Zellwand.

Führen Sie Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper ein, die an die Primärantikörper binden.

Waschen Sie, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und tragen Sie einen Fluoreszenzfarbstoff auf, der an Zellulose bindet und die Zellwand markiert.

Fügen Sie ein Eindeckmedium hinzu und verschließen Sie es mit einem Deckglas.

Unter dem Mikroskop hilft die Fluoreszenz des Farbstoffs und der gebundenen Antikörper dabei, Zellulose in pflanzlichen Zellwänden sichtbar zu machen, die mit Arabinogalactan-Proteinen oder Pektin kolokalisiert sind und deren gewebespezifische Verteilung aufweisen.

Um eine Inkubationskammer für die Reaktionsobjektträger vorzubereiten, legen Sie einige angefeuchtete Papiertücher auf den Boden einer Pipettenspitzenschachtel und wickeln Sie die Schachtel mit Alufolie ein. Übertragen Sie die Objektträger aus der Box in die Inkubationskammer. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Blockierlösung in jede Vertiefung. Nachdem Sie den Objektträger 10 Minuten lang inkubiert haben, entfernen Sie die Blocklösung. Waschen Sie dann alle Vertiefungen zweimal jeweils 10 Minuten lang mit PBS. Nach der Herstellung der primären Antikörperlösungen, wie im Manuskript beschrieben, führen Sie eine abschließende Wäsche der Vertiefungen mit destilliertem, deionisiertem Wasser für 5 Minuten durch.

Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung in die Reaktionsvertiefungen. Pipettieren Sie dann die Blockierungslösung in die Kontrollvertiefungen. Schließen Sie die Inkubationskammer. Lassen Sie es zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen und kühlen Sie es dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Bereiten Sie eine 1%ige Lösung des Sekundärantikörpers in Blockierungslösung vor. Es werden etwa 40 Mikroliter pro Vertiefung benötigt.

Decken Sie die Lösung mit Alufolie ab. Waschen Sie die Vertiefungen des Reaktionsobjektträgers zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem, entionisiertem Wasser für jeweils 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass keine Verstopfungslösung oder Ablagerungen in den Vertiefungen verbleiben. Pipettieren Sie die Sekundärantikörperlösung in alle Vertiefungen. Inkubieren Sie die Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden.

Auch hier werden die Vertiefungen des Reaktionsobjektträgers zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem, entionisiertem Wasser gewaschen. Geben Sie dann einen Tropfen Calcofluor-White in jede Vertiefung. Geben Sie ohne Waschen einen Tropfen Einbettmittel in jede Vertiefung und decken Sie jede Vertiefung mit einem Deckglas ab. Betrachten Sie die Probenschnitte im Reaktionsobjektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Verwenden Sie für jede Beobachtung einen UV-Filter, um durch das Calcofluor gefärbte Zellwände zu erkennen, und einen FITC-Filter, um die Immunlokalisation zu erkennen. Für eine bessere Visualisierung der Ergebnisse verwenden Sie ImageJ oder ein ähnliches Bildanalyseprogramm, um jedes UV-Filterbild mit dem entsprechenden FITC-Filterbild zusammenzuführen.