Verwendung eines Sandwich-ELISA zur Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts in einem Impfstoff

Beginnen Sie mit einer passivierten Assay-Platte, die mit Tollwut-immunogenen Glykoprotein-spezifischen monoklonalen Antikörpern und einem Blockierungsmittel beschichtet ist, um unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern.

Einführung von seriell verdünnten Referenz- und Test-Tollwutimpfstoffen mit abnehmendem Glykoproteingehalt. Versiegeln Sie die Platte, um eine Kontamination zu vermeiden.

Während der Inkubation interagieren immunogene Glykoproteine über eine spezifische antigene Stelle mit beschichteten monoklonalen Antikörpern.

Entfernen Sie nach der Inkubation den Film, saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Platte.

Overlay mit enzymkonjugierten Glykoprotein-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an eine andere antigene Stelle auf dem Glykoprotein binden und einen Immunkomplex bilden.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die ein Substrat und ein Chromogen enthält. Wenn das Substrat mit dem Enzym interagiert, bewirkt es die Oxidation des Chromogens, wodurch sich die Farbe der Lösung ändert.

Fügen Sie eine Stopplösung hinzu, um die Enzyme zu inaktivieren.

Messen Sie die Extinktion und erstellen Sie eine Referenzkurve anhand der Referenzwerte für den Impfstoff.

Identifizieren Sie den Bereich, in dem eine lineare Beziehung zwischen der Absorption und dem Glykoproteingehalt der Referenzimpfstoffverdünnungen besteht. Extrapolieren Sie dann den Glykoproteingehalt der Testimpfstoffverdünnungen auf der Grundlage der Absorption, die in diesen Bereich fällt.

Um die Klinge zu waschen, geben Sie 300 Mikroliter des Waschpuffers in jede Vertiefung. Aspirieren Sie dann vorsichtig und überführen Sie den Inhalt der Vertiefung in einen Behälter, der eine Lösung von 2,6 % Natriumhypochlorit enthält. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch fünfmal, um die sensibilisierte Platte ausgiebig zu waschen.

Drehen Sie danach die Mikroplatte um und lassen Sie sie eine Minute lang auf einem Blatt saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen. Der Referenzimpfstoff wird in einem Milliliter destilliertem Wasser so rekonstituiert, dass die Endkonzentration des Glykoproteins des Tollwutvirus 10 Mikrogramm pro Milliliter beträgt. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung des rekonstituierten Referenzimpfstoffs im Verdünnungsmittel vor, um eine Glykoproteinkonzentration des Tollwutvirus von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Als nächstes führen Sie sechs serielle zweifache Verdünnungen dieses Referenzimpfstoffs im Verdünnungsmittel durch, wie in Tabelle eins des Textprotokolls beschrieben. Verteilen Sie 200 Mikroliter des Verdünnungsmittels in doppelten Vertiefungen, die als Blindkontrolle dienen, und 200 Mikroliter pro Vertiefung für jede Referenzimpfstoffverdünnung in doppelter Ausfertigung.

Bereiten Sie dann eine 10-fache Verdünnung des getesteten Impfstoffs im Verdünnungsmittel vor und bereiten Sie sieben zweifache Serienverdünnungen des getesteten Impfstoffs in Verdünnungsmittel vor, wie in Tabelle zwei des Textprotokolls beschrieben. Verteilen Sie 200 Mikroliter jeder getesteten Impfstoffverdünnung in zweifacher Ausfertigung auf jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Decken Sie die Mikroplatte mit Klebefolie ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie danach den Film, aspirieren Sie vorsichtig und geben Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der eine 2,7%ige Natriumhypochloritlösung enthält. Um die Platte zu waschen, geben Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in jede Vertiefung. Aspirieren Sie vorsichtig und überführen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der eine 2,6%ige Natriumhypochloritlösung enthält.

Wiederholen Sie den Waschvorgang noch fünfmal, um das ungebundene Antigen zu entfernen. und konservieren Sie die an den beschichteten Antikörper gebundenen G-Protein-Trimere. Drehen Sie die gewaschene Mikroplatte um und lassen Sie sie eine Minute lang auf einem Blatt saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen. Verteilen Sie dann 200 Mikroliter der empfohlenen Verdünnung von Peroxidase-markierten monoklonalen D1-Antikörpern in Verdünnungsmittel in jeder Vertiefung

Decken Sie die Mikroplatte mit Klebefolie ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend den Film, saugen Sie vorsichtig ab und geben Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der eine 2,6%ige Natriumhypochloritlösung enthält. Um die Mikroplatte zu waschen, geben Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in jede Vertiefung

Aspirieren Sie vorsichtig und überführen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der eine 2,6%ige Natriumhypochloritlösung enthält. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch fünfmal, um den ungebundenen Peroxidase-markierten Antikörper zu entfernen. Drehen Sie die Wasch-Mikroplatte um und lassen Sie sie eine Minute lang auf einem Blatt saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen.

Verteilen Sie anschließend 200 Mikroliter Substrat-Chromogenlösung in jede Vertiefung. Versiegeln Sie die Mikroplatte mit einer Folie und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Geben Sie dann 50 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.

Wischen Sie vorsichtig die Unterseite der Mikroklinge ab und legen Sie sie in ein Spektralphotometer. Bestimmen Sie die optische Dichte bei 492 Nanometern für alle verwendeten Wells. Sammeln Sie diese Daten zur Analyse in einer Tabellenkalkulationsdatei. Erstellen Sie anschließend Diagramme sowohl für die Referenzimpfstoffkurve als auch für die optischen Dichtewerte, wie im Textprotokoll beschrieben.