Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel-System verkapselt sind

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Säugetierzellen, die in einem Hydrogelsystem eingekapselt sind, das die natürliche extrazelluläre Matrixumgebung nachahmt.

Entfernen Sie das Nährmedium. Mit einem Fixierungspuffer behandeln, um die Proteine zu vernetzen und die zelluläre Integrität zu erhalten.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die Detergens enthält, um die Zellmembran zu permeabilisieren.

Führen Sie in den nachfolgenden Schritten eine Blockierungslösung ein, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie einen primären Antikörpercocktail hinzu, der in die Zellen eindringt und spezifisch an zytoplasmatische Zwischenfilamente und den Zieltranskriptionsfaktor bindet.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper. Führen Sie fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper und eine Kernfärbung ein, um die DNA fluoreszierend zu markieren.

Entfernen Sie die ungebundenen Moleküle.

Montieren Sie die Hydrogelkultur mit einem Einbettmedium auf einen Objektträger.

Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die immungefärbten Zellen zu beobachten.

Saugen Sie zuerst das Medium aus jeder Vertiefung an. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit 1 Milliliter warmem DPBS. Geben Sie nach Abschluss des Waschvorgangs 750 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie dann die 24-Well-Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Fixierlösung aus jeder der Vertiefungen und entsorgen Sie das Fixiermittel in einem Behälter für gefährliche Abfälle. Geben Sie anschließend 1 Milliliter DPBS in die Probe und entsorgen Sie das DPBS sofort in einem Behälter für gefährliche Abfälle.

Fügen Sie anschließend 750 Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzu, um die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Wippe bei 15 Umdrehungen pro Minute zu permeabilisieren. Nach einer Stunde aspirieren Sie die Permeabilisierungslösung und geben Sie 750 Mikroliter Blockierungslösung in die Probe. Lassen Sie die Probe drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Wippe. Verdünnen Sie dann die gewünschten Primärantikörper mit der Antikörperverdünnungslösung.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Probe. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie dann die Proben dreimal eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 15 Umdrehungen pro Minute mit PBST.

Anschließend werden die entsprechenden Sekundärantikörper und 5 mg/ml DAPI-Stammlösung verdünnt, um eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter der Lösung zu jeder Probe. Als nächstes bedecken Sie die 24-Well-Platte mit Aluminiumfolie und inkubieren die Platte über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Am nächsten Tag aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen die Proben dreimal mit PBST, jeweils 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Positionieren Sie als Nächstes einen Tropfen des fest abbindenden Einbettmediums auf der Oberfläche eines Objektträgers und legen Sie die Probe auf das Eindeckmedium. Verwenden Sie abschließend Nagellack, um die Proben auf dem Glasdeckel zu versiegeln, um eine Kontamination oder Bewegung der Probe zu verhindern.