Kontrollierte Infusion von Aβ-Peptid-spezifischen Antikörpern und Aβ-Oligomeren in den Hippocampus der Ratte

Nehmen Sie eine wache Ratte mit zwei Führungskanülen, die bilateral in den Hippocampus implantiert sind.

Die Kanülen sind mit subkutan implantierten osmotischen Pumpen verbunden, die Amyloid-beta- bzw. Aβ-spezifische und Kontrollantikörper enthalten.

Eine hohe Antikörperkonzentration innerhalb der Pumpe induziert eine Wasserdiffusion aus dem umgebenden Gewebe durch die äußere semipermeable Membran, wodurch sich die osmotische Schicht erweitert.

Diese Expansion komprimiert das Antikörperreservoir und ermöglicht so eine kontrollierte Antikörperfreisetzung.

Befestigen Sie zwei interne Kanülen an sterilen, mit Wasser gefüllten Kathetern, die an eine Infusionspumpe angeschlossen sind.

Füllen Sie die Kanülen mit Wasser.

Saugen Sie als Nächstes ein kleines Volumen Luft an, wodurch eine Blase entsteht.

Füllen Sie nun die Kanülen mit neurotoxischen Aβ-Oligomeren, löslichen Aggregaten von Aβ-Peptiden.

Führen Sie die Innenkanülen in die Führungskanülen ein. Starten Sie die Pumpe für eine kontrollierte Abgabe der Oligomere, wobei Sie die Luftblase verwenden, um einen Rückfluss zu verhindern und die Infusionsgeschwindigkeit zu verfolgen.

Verabreichen Sie wiederholte Oligomerinjektionen für die erforderliche Dauer.

Das Modell ist bereit für die Untersuchung von Aβ-Oligomer-Antikörper-Wechselwirkungen.

Füllen Sie die osmotischen Pumpen einen Tag vor der Installation mit 6E10-Antikörper oder Kontroll-IgG1-Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Pumpen in steriles destilliertes Wasser und halten Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Pumpen zu aktivieren.

Nachdem die Ratte mit 3 % Isofluran betäubt und zwischen den Schulterblättern rasiert wurde, desinfizieren Sie die Haut mit einer Lösung aus 2 % Chlorhexidingluconat und 2 % Isopropylalkohol. Nachdem Sie mit einem Skalpell zwischen den Schulterblättern einen Schnitt von 2 Zentimetern gemacht haben, lokalisieren Sie die PE-50-Katheter, die mit der Führungskanüle verbunden sind.

Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell die Enden der PE-50-Katheter ab, die Zahnzement enthalten. Schließen Sie die osmotischen Pumpen an die PE-50-Katheter an und fügen Sie etwas Zahnzement an der Pumpe und dem Katheterübergang hinzu, um die Verbindung zu sichern. Zum Schluss nähen Sie die Haut mit 4/0-Nähten fest. Setzen Sie das Tier zurück in seinen Käfig auf ein warmes Wärmekissen und überwachen Sie es, während es aus der Isofluran-Anästhesie erwacht.

Lassen Sie die Lösung nach der Herstellung der Amyloid-Beta-Oligomerlösung, wie zuvor berichtet, vor der Infusion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur dynamisch und spontan aggregieren. Füllen Sie dann jede Spritze mit 5 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser.

Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell zwei PE-50-Katheter auf eine Länge von etwa 60 Zentimetern. Verwenden Sie zwei 1-Milliliter-Spritzen, die mit 21-Gauge-Nadeln ausgestattet sind, um beide Katheter mit sterilem destilliertem Wasser zu füllen. Während die 1-Milliliter-Spritzen an Ort und Stelle bleiben, verbinden Sie die freien Enden an einem Ende jedes Katheters mit den Hamilton-Spritzen. Entfernen Sie die 1-Milliliter-Spritzen und prüfen Sie, ob sich keine Luftblasen in den Kathetern befinden.

Führen Sie die innere Kanüle am Ende der PE-50-Katheter ein. Verwenden Sie die Hamilton-Spritzen, um jede interne Kanüle bis zu 1 Mikroliter zu füllen, und erzeugen Sie dann eine Luftblase, indem Sie den Kolben bis zur 2-Mikroliter-Markierung zurückziehen.

Mischen Sie nun die Amyloid-Beta-Oligomerlösung, indem Sie mit einer Spitze mit minimaler Adhärenz auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen. Füllen Sie dann beide internen Kanülen mit 1,5 Mikrolitern Amyloid-Beta-Oligomerlösung, indem Sie die Kolben auf 3,5 Mikroliter zurückziehen.

Markieren Sie als Nächstes Linien vor und nach der Luftblase in beiden Kathetern. Dies dient als Kontrollpunkt für die laufende Infusion. Lege die wache Ratte in einen Kuschelgriff und mache ihren Kopf bewegungsunfähig. Entfernen Sie die Dummy-Kanüle aus der Zwei-Führungskanüle und führen Sie dann die zuvor vorbereitete Innenkanüle in die Führungskanüle ein. Vergewissern Sie sich, dass sie vollständig eingeführt und gut an der Basis der Führungskanüle befestigt sind. Befreien Sie nun die Ratte aus dem Kuschelgriff und setzen Sie sie zurück in ihren Käfig, um den Handhabungsstress zu begrenzen.

Schalten Sie die Infusionspumpe ein und injizieren Sie 1 Mikroliter Amyloid-Beta-Oligomerlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute. Prüfen Sie während der Infusion, ob sich der Kolben der Spritze von 3,5 Mikrolitern auf 2,5 Mikroliter bewegt und ob sich die Luftblasen in beiden PE-50-Kathetern kontinuierlich bewegen. Überprüfen Sie die Ratte, um sicherzustellen, dass sich die Katheter nicht zusammendrehen.

Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion weitere 5 Minuten an Ort und Stelle, um eine effiziente Diffusion der Amyloid-Beta-Oligomerlösung zu ermöglichen. Bringen Sie die Ratte nach der Infusion wieder in den Kuschelgriff und entfernen Sie die interne Kanüle und die Kanüle mit verschlossener Führung, um einen Rückfluss der injizierten Lösung zu verhindern. Platzieren Sie die Dummy-Kanüle, die kurz vor dem Winkelarm der Führungskanüle gestoppt hat. Bringen Sie das Tier schließlich in seinen Käfig zurück.