Ein Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirus-VLPs an Darmbakterien

Nehmen Sie ein Röhrchen, das eine Suspension menschlicher Darmbakterien enthält.

Fügen Sie humane Norovirus-Virus-ähnliche Partikel oder VLPs hinzu. Die VLPs enthalten ein intaktes virales Kapsid, aber keine genomische RNA, so dass sie für den Menschen nicht infektiös sind.

Während der Inkubation binden die VLP-Kapsidproteine an spezifische Kohlenhydrate, die auf der Bakterienoberfläche exprimiert werden, und bilden VLP-Bakterien-Komplexe.

Zentrifugieren Sie, um die Komplexe zu pelletieren und die ungebundenen VLPs zu verwerfen.

Führen Sie eine proteinhaltige Blockierungslösung ein, um unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren und die Hintergrundfärbung in den nachfolgenden Schritten zu reduzieren.

Fluoreszenzmarkierte VLP-spezifische Antikörper zugeben und inkubieren.

Die Antikörper binden an ihre Zielstellen auf dem VLP-Kapsid und markieren so die VLP-Bakterienkomplexe.

Zentrifugieren Sie, um die Komplexe zu pelletieren. Ungebundene Antikörper werden verworfen und das Pellet in einem Durchflusszytometrie-Puffer resuspendiert.

Mit einem Durchflusszytometer können Fluoreszenzsignale detektiert werden, die von VLP-Bakterienkomplexen emittiert werden, und so der Prozentsatz der gebundenen Bakterien in der Probe quantifiziert werden.

Nachdem Sie die Reagenzien, Antikörper und Bakterien, wie im Manuskript beschrieben, vorbereitet haben, stellen Sie alle Materialien in einer BSL II-Biosicherheitswerkbank zusammen.

Virusähnliche Partikel für humane Noroviren sind als BSL-II-Erreger aufgeführt, und alle Arbeiten, die mit VLPs durchgeführt werden, sollten in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.

Geben Sie 10 Mikrogramm humane Norovirus-VLPs in jedes Röhrchen mit den Bakterien und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit konstanter Rotation. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 10.000 g g.

Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 Milliliter PBS. Nach einmaliger Wiederholung der Waschschritte zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut bei 10.000 mal g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das VLP-Bakterienpellet in 150 Mikrolitern 5%igem Blockierungspuffer

.

Ein häufiger Fehler, der auftritt, ist, dass die Schläuche vertauscht und die falsche Behandlung hinzugefügt wird. Um dies zu verhindern, ordnen Sie alle Tuben in Linien an, die der richtigen Behandlung entsprechen, und fügen Sie eine Behandlung auf einmal zu den Tuben hinzu.

Bereiten Sie für jede Bakterienprobe 50 Mikroliter verdünnten humanen Norovirus-G2-Antikörper vor. Verdünnen Sie den Antikörper mit einem 5%igen Blockierungspuffer von 1 bis 125 für E. coli-Fallproben. Bereiten Sie 50 Mikroliter verdünnten Isotyp-Antikörper für jede Bakterienprobe unter Verwendung der gleichen Verdünnungsverhältnisse vor. Teilen Sie jede Attachment-Assay-Probe in 350-Mikroliter-Aliquote auf, indem Sie sie in saubere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Um ungefärbte Kontrollen zu erhalten, fügen Sie dem ersten Aliquot jeder Bakterienprobe 50 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu. Für die gefärbten Proben werden 50 Mikroliter der G2-Antikörperverdünnung zum zweiten Satz von Aliquoten hinzugefügt. Erstellen Sie die Isotypkontrollen, indem Sie 50 Mikroliter des verdünnten Isotyp-Antikörpers zum dritten Satz von Aliquoten hinzufügen.

Inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln. Zentrifugieren Sie dann alle Proben 5 Minuten lang bei 10.000 mal g. Die Überstände werden verworfen und jede Probe in 150 Mikrolitern FCSB resuspendiert. Zentrifugieren Sie erneut alle Proben bei 10.000 mal g für 5 Minuten. Auch hier werden die Überstände verworfen und die Proben in 100 Mikrolitern FCSB resuspendiert.

Nachdem Sie die Proben ein letztes Mal zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, werden die Proben in 150 Mikrolitern FCSB resuspendiert. Jede Probe wird in ein Röhrchen mit 400 Mikrolitern FCSB für ein Gesamtvolumen von 550 Mikrolitern überführt. Lagern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, bis sie durchflusszytometrisch analysiert werden.