Ein Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirus-VLPs an Darmbakterien
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:24 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein Röhrchen, das eine Suspension menschlicher Darmbakterien enthält.
Fügen Sie humane Norovirus-Virus-ähnliche Partikel oder VLPs hinzu. Die VLPs enthalten ein intaktes virales Kapsid, aber keine genomische RNA, so dass sie für den Menschen nicht infektiös sind.
Während der Inkubation binden die VLP-Kapsidproteine an spezifische Kohlenhydrate, die auf der Bakterienoberfläche exprimiert werden, und bilden VLP-Bakterien-Komplexe.
Zentrifugieren Sie, um die Komplexe zu pelletieren und die ungebundenen VLPs zu verwerfen.
Führen Sie eine proteinhaltige Blockierungslösung ein, um unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren und die Hintergrundfärbung in den nachfolgenden Schritten zu reduzieren.
Fluoreszenzmarkierte VLP-spezifische Antikörper zugeben und inkubieren.
Die Antikörper binden an ihre Zielstellen auf dem VLP-Kapsid und markieren so die VLP-Bakterienkomplexe.
Zentrifugieren Sie, um die Komplexe zu pelletieren. Ungebundene Antikörper werden verworfen und das Pellet in einem Durchflusszytometrie-Puffer resuspendiert.
Mit einem Durchflusszytometer können Fluoreszenzsignale detektiert werden, die von VLP-Bakterienkomplexen emittiert werden, und so der Prozentsatz der gebundenen Bakterien in der Probe quantifiziert werden.
Nachdem Sie die Reagenzien, Antikörper und Bakterien, wie im Manuskript beschrieben, vorbereitet haben, stellen Sie alle Materialien in einer BSL II-Biosicherheitswerkbank zusammen.
Virusähnliche Partikel für humane Noroviren sind als BSL-II-Erreger aufgeführt, und alle Arbeiten, die mit VLPs durchgeführt werden, sollten in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
Geben Sie 10 Mikrogramm humane Norovirus-VLPs in jedes Röhrchen mit den Bakterien und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit konstanter Rotation. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 10.000 g g.
Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 Milliliter PBS. Nach einmaliger Wiederholung der Waschschritte zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut bei 10.000 mal g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das VLP-Bakterienpellet in 150 Mikrolitern 5%igem Blockierungspuffer
.Ein häufiger Fehler, der auftritt, ist, dass die Schläuche vertauscht und die falsche Behandlung hinzugefügt wird. Um dies zu verhindern, ordnen Sie alle Tuben in Linien an, die der richtigen Behandlung entsprechen, und fügen Sie eine Behandlung auf einmal zu den Tuben hinzu.
Bereiten Sie für jede Bakterienprobe 50 Mikroliter verdünnten humanen Norovirus-G2-Antikörper vor. Verdünnen Sie den Antikörper mit einem 5%igen Blockierungspuffer von 1 bis 125 für E. coli-Fallproben. Bereiten Sie 50 Mikroliter verdünnten Isotyp-Antikörper für jede Bakterienprobe unter Verwendung der gleichen Verdünnungsverhältnisse vor. Teilen Sie jede Attachment-Assay-Probe in 350-Mikroliter-Aliquote auf, indem Sie sie in saubere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.
Um ungefärbte Kontrollen zu erhalten, fügen Sie dem ersten Aliquot jeder Bakterienprobe 50 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu. Für die gefärbten Proben werden 50 Mikroliter der G2-Antikörperverdünnung zum zweiten Satz von Aliquoten hinzugefügt. Erstellen Sie die Isotypkontrollen, indem Sie 50 Mikroliter des verdünnten Isotyp-Antikörpers zum dritten Satz von Aliquoten hinzufügen.
Inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln. Zentrifugieren Sie dann alle Proben 5 Minuten lang bei 10.000 mal g. Die Überstände werden verworfen und jede Probe in 150 Mikrolitern FCSB resuspendiert. Zentrifugieren Sie erneut alle Proben bei 10.000 mal g für 5 Minuten. Auch hier werden die Überstände verworfen und die Proben in 100 Mikrolitern FCSB resuspendiert.
Nachdem Sie die Proben ein letztes Mal zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, werden die Proben in 150 Mikrolitern FCSB resuspendiert. Jede Probe wird in ein Röhrchen mit 400 Mikrolitern FCSB für ein Gesamtvolumen von 550 Mikrolitern überführt. Lagern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, bis sie durchflusszytometrisch analysiert werden.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Wechselwirkung zwischen virusähnlichen Partikeln (VLPs) des humanen Norovirus und menschlichen Darmbakterien. Die Methodik umfasst die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der Bindung von VLPs an bakterielle Oberflächen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Virologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Der humane Norovirus ist eine bedeutende Ursache der Gastroenteritis.
- Virusähnliche Partikel sind nicht infektiös und nützlich für die Untersuchung viraler Wechselwirkungen.
- Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen VLPs und Bakterien kann Einblicke in die virale Pathogenese liefern.
- Mithilfe der Durchflusszytometrie lässt sich die Bildung komplexer Strukturen präzise quantifizieren.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Bindungseigenschaften von menschlichen Norovirus-VLPs an Darmbakterien.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Quantifizierung von VLP-Bakterien-Komplexen.
- Verbesserung des Verständnisses über die Rolle von Bakterien bei Norovirus-Infektionen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von humanen Norovirus-VLPs und bakteriellen Suspensionen.
- Inkubation von VLPs mit Bakterien zur Komplexbildung.
- Verwendung von Blockierungslösungen zur Minimierung unspezifischer Bindung.
- Durchflusszytometrie zur Detektion und Quantifizierung gebundener Bakterien.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Bildung von VLP-Bakterien-Komplexen wurde beobachtet.
- Mittels Durchflusszytometrie ließ sich der Prozentsatz gebundener Bakterien effektiv quantifizieren.
- Blockierungslösungen verringerten die Hintergrundanfärbung signifikant.
- Die Methodik zeigte Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen Rahmen, um virale-bakterielle Wechselwirkungen zu untersuchen.
- Die Durchflusszytometrie ist ein wertvolles Werkzeug zur Quantifizierung dieser Wechselwirkungen.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Forschungsarbeiten zur Pathogenese von Noroviren beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Bindung von menschlichen Norovirus-VLPs an Darmbakterien schließt eine wichtige Wissenslücke im Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wirt, Mikrobe und Virus, die für die Biologie infektiöser Krankheiten relevant sind. Dieser Assay ermöglicht eine präzise Messung der Bildung von VLP-Bakterien-Komplexen und unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken sowie die Validierung von Zielstrukturen in der frühen Entdeckungsphase. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit für nachgeschaltete translations- und präklinische Forschung, die auf virale Pathogenese und Interventionsstrategien ausgerichtet ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Norovirus, Wirt und Mikrobiom auf molekularer Ebene.
- Unterstützt die funktionelle Validierung bakterieller Oberflächenkohlenhydrate als Zielstrukturen für die Virusbindung.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung spezifischer VLP-Bakterien-Assoziationen.
- Liefert quantitative Daten zur Priorisierung von Zielstrukturen und zur Weiterentwicklung von Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert einen standardisierten, reproduzierbaren Durchflusszytometrie-Assay zur Quantifizierung der Virusbindung.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die für vergleichende Analysen zwischen bakteriellen Stämmen oder Bedingungen geeignet sind.
- Ermöglicht die Skalierbarkeit des Assays und die Wiederverwendung der Plattform für umfassendere Screening-Anwendungen.
- Ermöglicht die zuverlässige Bewertung von Kandidateninhibitoren oder Modulatoren der VLP-Bakterien-Bindung.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung auf krankheitsrelevante Systeme, indem die Wechselwirkungen von Norovirus mit humanen Darmbakterien modelliert werden.
- Bietet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Virus-Eintrittsmechanismen.
- Ergänzt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von antiviralen Strategien oder Strategien zur Modulation des Mikrobioms.
- Unterstützt die Identifizierung translationaler Biomarker für Endpunkte der Virus-Bakterien-Wechselwirkungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser auf Durchflusszytometrie basierende Test integriert sich in die frühen Phasen der Entdeckung und Identifizierung von Leitstrukturen und verbindet mechanistische Studien mit der Entwicklung präklinischer Modelle.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert die Bindung von VLPs an bakterielle Zielstrukturen und unterstützt die Überprüfung von Hypothesen sowie die Aufklärung von Signalwegen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Messwerte zur Standardisierung von Assays und zur Bewertung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich der Bindung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und Kontrollen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Bindungsdaten mit präklinischen Modellen der Norovirusinfektion.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Assay-Plattform für vielfältige Studien zu Virus-Wirt-Interaktionen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten in der Erforschung des viralen Eintritts.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Assay-Abläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch sowie die Kapitalallokation für Programme zur Entdeckung von Antiviratika.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und interventionsbasierten Strategien.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Durchflusszytometrie und der Biologie von Virus-Wirt-Wechselwirkungen.
- Setzt Zugang zu einer BSL-II-Biosicherheitsinfrastruktur und analytischen Geräten voraus.
- Erfordert eine strenge, standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Kontrollen und Antikörperreagenzien.
- Kann Anpassungen für unterschiedliche Bakterienstämme oder virale VLPs erfordern.
- Hängt von der Verfügbarkeit hochwertiger, spezifischer Antikörper für den Nachweis ab.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026