Ein In-vivo-Assay zum Nachweis von Mitophagie in transgenen Nematoden

Nehmen wir transgene Nematoden, bei denen Muskelzellen an der Körperwand grünes Fluorophor-markiertes DCT-1, ein äußeres mitochondriales Membranprotein, und ein rotes Fluorophor-markiertes LGG-1, ein Phagophor-Membranprotein, exprimieren.

Lege die Würmer auf ein Wachstumsmedium, das ein Mitophagie-induzierendes Medikament enthält.

Das Medikament schädigt die zellulären Mitochondrien und leitet die Mitophagie oder selektive Beseitigung geschädigter Mitochondrien ein.

DCT-1 auf geschädigten Mitochondrien durchläuft eine Ubiquitinierung und Phosphorylierung, was die Interaktion mit LGG-1 auf der Phagophormembran erleichtert.

Das Phagophor dehnt sich um die Mitochondrien herum aus und bildet ein Autophagosom, das auf den lysosomalen Abbau abzielt.

Legen Sie die Nematoden in einem Narkosemittel auf einen Objektträger, um sie zu immobilisieren, und legen Sie ein Deckglas an.

Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop gelbe Flecken in den Muskelzellen, die auf die Kolokalisation von DCT-1 mit grüner Fluoreszenz und LGG-1 mit roter Fluoreszenz hinweisen. Dies bestätigt das Auftreten einer Mitophagie.

Am ersten Tag werden L4-Larven von transgenen Tieren, die sowohl DCT-1::GFP als au