Ein Kapillarelektrophorese-Immunoassay für den Nachweis von Protein-Biomarkern

Um einen krankheitsassoziierten Protein-Biomarker nachzuweisen, nehmen Sie eine Immunoassay-Platte.

Die Platte enthält vorgefüllte Trenn- und Stapelmatrizen, die für die größenbasierte Proteintrennung erforderlich sind.

Laden Sie die Proteine und Immunoassay-Reagenzien in unterschiedliche Plattenvertiefungen.

Initiieren Sie den Lauf in einem CEI-Analysegerät. Die Kapillarpatrone im Analysator saugt die Matrizen an, um in jeder Kapillare ein Gel zu bilden.

Die Kapillare saugt dann die Proteine ab. Bei der Elektrophorese wandern die Proteine und trennen sich anhand ihres Molekulargewichts.

Der Analysator führt UV-Licht ein und immobilisiert die Proteine in der Kapillare.

Der Waschpuffer entfernt die Matrices und ungebundenen Proteine. Der Blockierungspuffer fließt dann ein und blockiert unspezifische Interaktionsstellen.

Der Analysator führt primäre Antikörper ein, die an den Biomarker binden, gefolgt von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern, die mit den primären Antikörpern interagieren.

Waschen Sie das Chemilumineszenzsubstrat und fügen Sie es hinzu. Die Peroxidase oxidiert das Substrat und emittiert Lumineszenz.

Messen Sie die Lumineszenzintensität und vergleichen Sie sie mit dem Proteinstandard für den Biomarker-Nachweis.

Nachdem Sie 100 Mikroliter humane Thrombozytenlysate von ALS-Patienten und gesunden Probanden gesammelt haben, füllen Sie die selbst erstellten Vorlagen für das Kapillarlayout und die Probenvorbereitung aus. Die Tabelle zur Vorbereitung der Probenmischung ist dynamisch und berechnet automatisch, wie viel Volumen von der Quelle entfernt werden sollte. Legen Sie alle Assay-Reagenzien auf Eis, mit Ausnahme der Standardpackung, die bei Raumtemperatur verbleiben sollte.

Zur Herstellung des fluoreszierenden Mastermixes geben Sie 40 Mikroliter deionisiertes Wasser in ein klares Röhrchen mit DVB-T und geben Sie 20 Mikroliter 10X Probenpuffer und 20 Mikroliter der vorbereiteten 400-Millimolar-DTT-Lösung in das rosa Röhrchen aus dem Assay-Kit.

Zur Vorbereitung der biotinylierten Leiter geben Sie 16 Mikroliter deionisiertes Wasser, 2 Mikroliter 10X Probenpuffer und 2 Mikroliter der vorbereiteten 400-millimolaren DVB-T-Lösung in das weiße Röhrchen, das im Kit enthalten ist. Nach schonendem Mischen wird die Leiterlösung vor der Denaturierung in ein 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen überführt.

Geben Sie 1,5 Mikroliter 10X Probenpuffer und 148,5 Mikroliter deionisiertes Wasser in ein 600-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie mit einem Vortex, bevor Sie das Röhrchen auf Eis stellen. Geben Sie die gewünschten Antikörper direkt in das Verdünnungsmittel, wie in der Tabelle angegeben, und spülen Sie die Pipettenspitze mehrmals, um eine homogene Antikörperlösung zu erhalten.

Um die Kapillarprobenmischung vorzubereiten, öffnen Sie alle PCR-Röhrchen und geben Sie 1,6 Mikroliter Aliquots fluoreszierenden 5X-Probenpuffers in jedes Röhrchen, wie in der Tabelle angegeben, unter Verwendung einer umgekehrten Pipettiertechnik, wobei jedes Röhrchen sofort verschlossen wird, wenn der Puffer hinzugefügt wird. Wenn der gesamte Puffer hinzugefügt wurde, öffnen Sie alle Röhrchen und fügen Sie einen 0,1-fachen Probenpuffer in Volumina hinzu, wie in der Tabelle angegeben, und schließen Sie jedes Röhrchen sofort, wenn der Puffer hinzugefügt wird.

Öffnen Sie als Nächstes alle Röhrchen, fügen Sie die Proteinproben hinzu, wie in der Tabelle angegeben, und schließen Sie sofort jeden Röhrchendeckel. Wenn alle Proben hinzugefügt wurden, zentrifugieren Sie alle Röhrchen kurz in einer Tischzentrifuge. Zum Mischen vortexen und erneut zentrifugieren.

Am Ende der zweiten Zentrifugation werden alle Röhrchen in einen Thermocycler mit beheiztem Deckel gelegt und die Proben unter den angegebenen Bedingungen denaturiert. Am Ende der Denaturierung zentrifugen, mischen und zentrifugieren Sie die Proben erneut und legen Sie alle Röhrchen in ein Röhrchengestell auf Eis.

Anhand der Abbildung sind 10 Mikroliter Streptavidin-Meerrettichperoxidase in die Vertiefung D1, 10 Mikroliter des entsprechenden Sekundärantikörpers in die Vertiefungen D2 bis D5, 10 Mikroliter Antikörperverdünnungsmittel in jede Vertiefung in Reihe B und Vertiefung C1, 10 Mikroliter des entsprechenden Primärantikörpers in die Vertiefungen C2 bis C25, 5 Mikroliter biotinylierte Leiter aus dem PCR-Röhrchen Nummer 1 in die Vertiefung A1 zu geben. 3 Mikroliter Probe in die Reihen A2 bis A25 und 15 Mikroliter frisch zubereitetes Luminolperoxid in jede Vertiefung der Reihe E.

Das Pipettieren der Probenmischung und der Reagenzien in der richtigen Reihenfolge in die winzige Vertiefung ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, daher sollte es sehr sorgfältig durchgeführt werden.

Geben Sie dann 500 Mikroliter Waschpuffer in jede dafür vorgesehene Waschpuffervertiefung und schleudern Sie den Platteninhalt durch Zentrifugation herunter.