Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Nehmen Sie eine Kryosektion des Nierenzellkarzinomgewebes, die infiltrierende CD8+ T-Zellen in ihrer Tumormikroumgebung zeigt.

Behandeln Sie es mit Aceton, um das Gewebe zu fixieren und zu permeabilisieren. Waschen, um überschüssiges Aceton zu entfernen.

Fügen Sie Avidin hinzu, um endogenes Gewebebiotin zu sättigen. Fügen Sie als Nächstes Biotin hinzu, um immobilisierte Avidin-Bindungsstellen zu blockieren und unspezifische Wechselwirkungen zu minimieren.

Tragen Sie ein immunglobuline enthaltendes Serum auf, um die Fc-Rezeptoren der Immunzellen zu blockieren und eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie einen primären Antikörpercocktail hinzu, der auf CD8, einen zytotoxischen T-Zell-Marker, und PD-1 und Tim-3 abzielt, inhibitorische Rezeptoren, die von CD8+ T-Zell-Subpopulationen exprimiert werden, die gegen Immuntherapie resistent sind.

Einführung unterschiedlicher Fluorophor-markierter Sekundärantikörper, die auf Anti-CD8- und Anti-Tim-3-Antikörper abzielen.

Fügen Sie biotinylierte Sekundärantikörper hinzu, die auf Anti-PD-1-Antikörper abzielen, und eine andere Fluorophor-markierte Streptavidin-Bindung, die an Biotin bindet.

Tragen Sie ein farbstoffhaltiges Eindeckmedium auf, um die Zellkerne zu färben, und legen Sie ein Deckglas an.

Erfassen Sie multispektrale Fluoreszenzbilder, um die tumorinfiltrierenden CD8+ T-Zellen und die immuntherapieresistenten Subpopulationen, die PD-1, Tim-3 oder beides exprimieren, zu identifizieren.

Trocknen Sie die Objektträger nach dem Auftauen vorsichtig mit einem Papiertuch um die Gewebeabschnitte herum und umschließen Sie die Gewebe mit einem hydrophoben Barrierestift. Wenn die Barriere getrocknet ist, fixieren Sie die Proben 5 Minuten lang in 100 % Aceton, gefolgt von 2 Minuten Lufttrocknung. Waschen Sie dann die Objektträger 10 Minuten lang in TBS.

Die Objektträger mit drei Tropfen 0,1% Avidin 10 Minuten im Dunkeln vorbehandeln. Tippen oder streichen Sie dann auf die Objektträger, um das Gewebe mit der Avidin-Lösung zu bedecken. Geben Sie drei Tropfen 0,01 % Biotin in jede Probe und klopfen oder schnippen Sie das Biotin über die Proben, gefolgt von einer TBS-Wäsche, wie gerade gezeigt. Blockieren Sie dann jede unspezifische Bindung mit 100 Mikrolitern 5% normalem Serum bei TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation klopfen Sie auf die Objektträger, um das überschüssige Serum zu entfernen, und inkubieren Sie die Objektträger in 100 Mikrolitern des primären Antikörpercocktails von Interesse für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie die mit Antikörpern markierten Objektträger 5 Minuten lang in TBST.

Nach dem Trocknen werden die Zellen 30 Minuten lang in der befeuchteten Kammer mit 100 Mikrolitern des Sekundärantikörper-Cocktails von Interesse markiert, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in TBS. Inkubieren Sie die getrockneten mit Sekundärantikörpern markierten Objektträger 30 Minuten lang mit 100 Mikrolitern des interessierenden tertiären Antikörpercocktails, gefolgt von einer abschließenden 10-minütigen TBS-Wäsche.

Trocknen Sie am Ende der Wäsche die Objektträger und befestigen Sie die Gewebe mit dem mit DAPI ergänzten Eindeckmedium. Decken Sie dann jede Folie mit einem Deckglas ab und lassen Sie das Eindeckmedium mindestens 2 Stunden lang aushärten.

Um die Objektträger zu scannen, öffnen Sie die Mikroskopsoftware und laden Sie das Bildscanprotokoll. Legen Sie den ersten Objektträger auf den Mikroskoptisch. Klicken Sie dann in der Steuerungsleiste auf "Belichtung einstellen" und passen Sie die Belichtungszeit für jeden Filter an, bis ein ausreichendes, aber nicht sättigendes Signal erhalten wird.

Klicken Sie im oberen Bereich auf Start, und öffnen Sie den Lab-ID-Ordner. Geben Sie die ID der ersten Folie ein, und klicken Sie auf Weiter.

Um einen Überblick über den Objektträger unter hellem Feldlicht bei 4-facher Vergrößerung zu erhalten, klicken Sie auf Monochrome Imaging und Find Specimen. Um den zu scannenden Gewebebereich auszuwählen, drücken Sie die Strg-Taste und verwenden Sie den Cursor, um die interessierenden Bereiche bei 4-facher Vergrößerung auszuwählen oder abzuwählen.

Um ein fluoreszierendes Rot-Blau-Grün-Bild jeder Region zu erhalten, klicken Sie auf "Low-Power Imaging". Für eine leistungsstarke Feldauswahl drücken Sie die Strg-Taste und wählen Sie mindestens fünf interessante Bereiche aus, die den Bereichen des Gewebes entsprechen, die bei der 20-fachen Vergrößerung gescannt werden.

Um dann eine multispektrale Bildaufnahme jedes Feldes zu erhalten, klicken Sie auf Hochleistungsbildgebung und dann auf Datenspeicher, um die Bilder im entsprechenden Lab-ID-Ordner zu speichern.