Eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung viraler Proteine in infizierten Zellen

Beginnen Sie mit einem Objektträger mit anhaftenden Wirtszellen.

Fügen Sie Viren hinzu und lassen Sie sie in die Wirtszellen eindringen.

Entfernen Sie das verbrauchte Medium. Fügen Sie frisches Medium hinzu, um die Synthese und den Transport viraler Proteine zu ermöglichen.

Verwenden Sie Paraformaldehyd, um die Zellmorphologie und die Proteinposition zu erhalten.

Fügen Sie Detergenzmoleküle hinzu, um die Zellen durchlässig zu machen.

Wenden Sie einen Blockierungspuffer an, um Nichtzielbindungsstellen zu blockieren.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die virale Zielproteine binden. Entfernen Sie ungebundene Antikörper.

Overlay mit roten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern zur Fluoreszenzmarkierung der viralen Proteine. Entfernen Sie ungebundene Antikörper.

Fügen Sie ein fluoreszierendes Einbettmedium hinzu, das Kernfarbstoff enthält, um die Kerne zu färben.

Beobachten Sie mit der konfokalen Mikroskopie die Position von rot fluoreszierenden viralen Proteinen und blau fluoreszierenden Wirtskernen.

Ein stärkeres rotes Signal um den blauen Bereich herum deutet auf eine zytoplasmatische Lokalisation hin, während ein stärkeres Signal auf der Innenseite auf eine Kernlokalisation hinweist.

Gleiche Signalpegel in und um den blauen Bereich deuten darauf hin, dass sich Proteine sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma befinden.

20 bis 24 Stunden vor der Virusinfektion werden 5 x 10⁴ humane embryonale Lungen- oder HEL-Fibroblastenzellen pro Vertiefung auf einen 4-Well-Objektträger mit 11 Millimetern in Wachstumsmedium ausgesät, um über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert zu werden.

Es ist wichtig, den Objektträger gründlich zu schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten und gleichzeitig darauf zu achten, dass das Kulturmedium nicht verschüttet wird. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Überstände der 70 % bis 80 % konfluenten Kulturen durch Medium-199, das 4-10 plaquebildende Einheiten pro Zelle enthält, und platzieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius unter 1-stündigem Schütteln.

Am Ende der Inkubation werden die Überstände durch frisches Wachstumsmedium ersetzt und die Zellen für die entsprechende experimentelle Infektionszeit wieder in den Inkubator gestellt. Für die Immunfluoreszenzfärbung der virusinfizierten Zellen waschen Sie die Zellen schnell dreimal mit PBS, gefolgt von einer 8- bis 10-minütigen Inkubation in 200 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd in PBS pro Well. Am Ende der Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Waschgang und permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,2% nichtionischem Tensid pro Vertiefung für 5 bis 10 Minuten.

Waschen Sie die permeabilisierten Zellen wie gezeigt dreimal in PBS und geben Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer in jede Vertiefung für eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend die entsprechende Konzentration des primären Antikörpers von Interesse in jede Vertiefung für eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation entfernen Sie alle ungebundenen Primärantikörper mit drei 10-minütigen Waschgängen in frischem Blockierungspuffer und geben Sie einen geeigneten Sekundärantikörper in jede Vertiefung für eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in einem Blockierungspuffer, wie gezeigt, gefolgt von einer Wäsche in PBS, und geben Sie einen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmedium, ergänzt mit DAPI, in jede Vertiefung. Legen Sie dann ein Deckglas über die Folie und versiegeln Sie das Deckglas mit transparentem Nagellack.

Durch sanften Druck beim Anbringen des Deckglases wird überschüssiges Eindeckmedium entfernt, wodurch die Aufnahme hochwertiger Bilder sichergestellt wird.

Um die nukleäre und zytoplasmatische Verteilung von ICP0 zu analysieren, öffnen Sie das Projekt in der konfokalen Anwendungssoftware und wählen Sie ein Bild aus. Öffnen Sie die Registerkarte "Menge" und wählen Sie im Menü "Extras" die Option "Interessenbereiche sortieren" aus. Wählen Sie Linie zeichnen, und ziehen Sie eine Längslinie quer durch die zu analysierende Zelle. Es erscheint ein Histogramm, das die Fluoreszenzintensität entlang der Linie sowohl für das interessierende Protein als auch für DAPI zeigt.

Basierend auf der Hintergrundfärbung wird ein konstanter Schwellenwert für die Intensität des interessierenden Proteins für die Analyse der subzellulären Verteilung des Proteins in jedem Experiment festgelegt. Wenn das Proteinsignal im Durchschnitt unter dem Schwellenwert im Kernbereich, aber über dem Schwellenwert jenseits der DAPI-Grenze liegt, kategorisieren Sie das Proteinsignal als überwiegend im Zytoplasma lokalisiert.

Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im gesamten Zellkern und außerhalb der Grenze des DAPI-Signals liegt, gruppieren Sie das Proteinsignal als Zellkern plus zytoplasmatische Lokalisation. Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im Zellkern liegt, aber im Durchschnitt unter dem Schwellenwert außerhalb der Grenze des DAPI-Signals, gruppieren Sie das Proteinsignal als Kernlokalisation.