Die Wirkung von Aspirin und Ibuprofen auf die phagozytäre Fähigkeit von Makrophagen

Beginnen Sie mit einer Pilzsuspension von Cryptococcus. Fügen Sie eine Lösung aus aus Pilzen gewonnenen Biopartikeln hinzu, die mit einem pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sind, um die Cryptococcus-Zellen zu färben.

Waschen Sie, um den ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Übertragen Sie die gefärbte Pilzsuspension in eine Multi-Well-Platte mit anhaftenden Makrophagen – oder phagozytären Immunzellen.

Führen Sie die minimale Hemmkonzentration eines Arzneimittels wie Aspirin oder Ibuprofen ein und inkubieren Sie, um die Aufnahme des Arzneimittels zu erleichtern.

Die Wirkstoffmoleküle interagieren mit der Cyclooxygenase-2 – einem Prostaglandin-synthetisierenden Enzym – und hemmen dessen Aktivität.

Dies verhindert die Umwandlung von Arachidonsäure in Prostaglandin, erhält den intrazellulären cAMP-Spiegel und verbessert die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen, wodurch die Internalisierung von Pilzen erleichtert wird.

Das pilzhaltige Phagosom verschmilzt mit dem Lysosom – einer sauren Organelle, die ein Phagolysosom mit saurem pH-Wert bildet und den Farbstoff fluoreszieren lässt.

Mit Medikamenten behandelte Zellen weisen eine höhere Fluoreszenz auf als unbehandelte Zellen, was auf die Wirksamkeit des Medikaments bei der Verbesserung der phagozytischen Fähigkeit von Makrophagen hindeutet.

Beginnen Sie mit einer Kultur der murinen Makrophagen-Zelllinie, die in vollständigem RPMI 1640-Medium gezüchtet wurde, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie zusätzlich eine Kultur von Cryptococcus neoformans vor, die in PBS auf die gewünschte Konzentration resuspendiert sind, wie im Textprotokoll erwähnt.

Um die Kryptokokkenzellen mit dem Phagozytose-Farbstoff zu färben, geben Sie 999 Mikroliter der Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 Mikroliter des Flecks in die Tube. Inkubieren Sie die Zellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, im Dunkeln, unter langsamem Rühren.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation durch erste Zentrifugation. Entsorgen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen mit PBS und wiederholen Sie den Waschschritt zwei weitere Male.

Geben Sie 100 Mikroliter der Cryptococcus neoformans-Zellsuspension in die Vertiefungen der 96-Well-Platte, die die kultivierten Makrophagen enthält.

Um die Wirkung der Testmedikamente auf die Makrophagen-Phagozytose zu untersuchen, geben Sie 100 Mikroliter des gewünschten Testmedikaments in geeignete Vertiefungen der 96-Well-Platte, wie im Textprotokoll beschrieben.

Inkubieren Sie die Platte 2 bis 6 Stunden lang in einem Kohlendioxid-Inkubator. Messen Sie am Ende der Inkubation die Fluoreszenz des phagozytären Farbstoffs.