Ein STAGE-Spitzenverfahren zur Entsalzung und Reinigung von Peptiden

Nehmen Sie eine STop And Go Extraction oder STAGE Tip, eine miniaturisierte Aufreinigungssäule.

Die Spitze enthält kleine Kieselsäurekügelchen, die an lange Kohlenwasserstoffketten gebunden sind, um eine hydrophobe Peptidreinigung auf der Grundlage von Wechselwirkungen

Mit Puffern waschen, die einen hohen Anteil an Acetonitril enthalten, um Harzverunreinigungen zu entfernen.

Führen Sie einen Bindungspuffer und eine Zentrifuge ein, wobei die Säule für eine optimale Peptidbindung äquilibriert wird.

Laden Sie eine vorverdaute Peptidprobe, die aus differenzierten neutrophilenähnlichen Zellen gewonnen wurde und Peptidfragmente und Verunreinigungen, einschließlich Salze, enthält.

Zentrifugieren, um die Probe durch die Säule zu leiten. Die Peptidfragmente binden über hydrophobe Wechselwirkungen an die Kohlenwasserstoffketten, während die Salze entfernt werden.

Fügen Sie den Bindungspuffer und die Zentrifuge hinzu und entfernen Sie die restlichen Verunreinigungen.

Führen Sie den hochacetonitrilhaltigen Puffer für die Elution ein.

Führen Sie den Puffer mit einer Spritze durch die Säule. Acetonitril bindet an die Kohlenwasserstoffketten und verdrängt die Peptidfragmente, die mit dem Puffer eluieren.

Führen Sie proteomische Profilerstellung durch, um die gereinigten Peptide zu identifizieren.

Packen Sie zunächst drei Schichten C18-Harz in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um für jede Peptidprobe eine STop And Go Extraction oder STAGE-Spitze zu konstruieren.

Stoppen Sie den enzymatischen Verdau der zuvor inkubierten Peptidproben durch Zugabe von 1 x 10 Volumina Stopplösung. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 13.200 U/min und überführen Sie den Überstand in ein neues 2-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie anschließend die STAGE-Spitzen mit 100 Mikrolitern 100 Prozent Acetonitril und zentrifugieren Sie die STAGE-Spitzen bei 1000 g für 2 Minuten oder bis die gesamte Flüssigkeit durch das C18-Harz gelangt ist.

Wiederholen Sie die STAGE-Spitzenwäschen mit 50 Mikrolitern Puffer B, gefolgt von 200 Mikrolitern Puffer A unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen.

Laden Sie die Proben in die STAGE-Spitzen, um sie 3 bis 5 Minuten lang bei 1000 g zu zentrifugieren. Waschen Sie dann die STAGE-Spitzen mit 200 Mikrolitern Puffer A durch Zentrifugation bei 1000 g für 3 bis 5 Minuten.

Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter Puffer B in jede STAGE-Spitze und eluieren Sie mit einer Spritze die Proben, die Puffer B enthalten, in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.

Sobald die Proben eluiert sind, trocknen Sie die Peptide 45 Minuten lang mit einer Vakuumzentrifuge. Führen Sie die Proben auf hochauflösender Massenspektrometrie unter den im Textmanuskript beschriebenen Bedingungen durch.

Um die Daten für die proteomische Profilerstellung zu verarbeiten, laden Sie die aus der Massenspektrometrie gewonnenen Rohdatendateien in die MaxQuant-Software hoch. Im Textmanuskript finden Sie alle Parameter der Software und deren Anpassungen.

Importieren Sie in den globalen Parametern die FASTA-Datei des Homo sapiens für die Sequenzidentifizierung, die Sie aus der Uniprot-Datenbank heruntergeladen haben und in der die Organismus-ID, die Anzahl der Proteine und das Downloaddatum der Datei aufgezeichnet sind.

Legen Sie die Anzahl der zu verarbeitenden Computerkerne fest, und wählen Sie Start aus. Nach Abschluss von MaxQuant wird ein "Kombiniert"-Ordner zusammen mit anderen Dateien generiert, die für das Hochladen in Datenrepositories benötigt werden.

Um die Daten zu analysieren, laden Sie die 'proteingroups.txt' in Perseus hoch und wählen Sie alle markierungsfreien Quantifizierungs- oder LFQ-Intensitätsdateien im 'Haupt'-Fenster aus. Filtern Sie die Zeilen, indem Sie Kontaminanten, Reverse-Peptide und Peptide, die nur nach Standort identifiziert werden, entfernen, und transformieren Sie die Daten nach Protokoll₂(x).

Um die Anzahl der in jedem Replikat nachgewiesenen Proteine zu beobachten, erstellen Sie ein numerisches Venn-Diagramm und legen Sie kategoriale Annotationen für jede Probe fest, indem Sie für alle Replikate einer biologischen Probe denselben Namen angeben.

Filtern Sie die Zeilen basierend auf einem gültigen Wert mit dem Protein, das in mehr als 50 Prozent der Replikate und in mindestens einer Gruppe identifiziert wurde. Um fehlende Werte für LFQ zu ersetzen, führen Sie die Imputation anhand der Normalverteilung durch.

Fügen Sie den Proteinzeilen Annotationsinformationen hinzu, die Sie von der Perseus-Website heruntergeladen haben, indem Sie txt.gz FASTA-Dateien in den Ordnern 'bin', 'conf' und 'annotation' hinzufügen. Bringen Sie spezifische Begriffe wie Proteinnamen, Gennamen und Genontologie ein.

Die Matrix ist jetzt vollständig und kann in Tools wie Diagrammen für die Hauptkomponentenanalyse, Heatmaps und Kategorieanreicherung visualisiert werden. Führen Sie statistische Tests durch, um signifikante Veränderungen der Proteinhäufigkeit zwischen den getesteten Bedingungen zu bestimmen.