Bewertung funktioneller SARS-CoV-2-neutralisierender Antikörper

Beginnen Sie mit seriell verdünntem Humanserum, das unterschiedliche Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern gegen das schwere akute respiratorische Syndrom, das Coronavirus 2 oder SARS-CoV-2 enthält.

Einführung von pseudotypisierten Viren mit Luciferase-RNA, Integrase und reverser Transkriptase, die in einer Lipiddoppelschicht mit SARS-CoV-2-Spike-Proteinen eingekapselt sind.

Antikörper neutralisieren die Viren auf der Grundlage der Serumverdünnung, wobei niedrigere Verdünnungen eine maximale Neutralisation aufweisen.

Führen Sie Zielzellen ein, die Angiotensin-konvertierende Enzym-2-Rezeptoren oder ACE2-Rezeptoren exprimieren, und Transmembranprotease Serin-2 oder TMPRSS2.

Bei höheren Serumverdünnungen interagieren nicht-neutralisierte Viren mit ACE2-Rezeptoren, während TMPRSS2 das Spike-Protein spaltet und so die Virusfusion ermöglicht.

Beim Eintritt wird die Luciferase-RNA in DNA umgekehrt transkribiert, die sich in das Wirtsgenom integriert und das Luciferase-Enzym produziert.

Ersetzen Sie das Medium durch einen Assay-Puffer, der Luciferase-Substrat und ein Lysierungsmittel enthält.

Die Zellen lysieren und setzen intrazelluläre Luziferase frei, die mit dem Substrat interagiert und eine hohe Lumineszenz erzeugt.

Quantifizieren Sie die Lumineszenz über Serumverdünnungen, um den Prozentsatz der viralen Neutralisation zu bestimmen – die Verdünnung, die eine fünfzigprozentige Neutralisation erreicht, stellt den Neutralisationstiter dar.

Geben Sie zunächst 50 Mikroliter DMEM mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin in die Reihen B bis H, Spalten 1 bis 12 einer weißen 96-Well-Platte.

Geben Sie 5 Mikroliter Rekonvaleszenzseren in die Vertiefungen der Reihe A, Spalten 2 bis 10, in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern DMEM mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin. 5 Mikroliter positive und negative Antiseren werden als Kontrollen in die Vertiefungen A11 und A12 gegeben.

Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Lösung aus den Vertiefungen der Reihe A und führen Sie eine zweifache serielle Verdünnung aller darunter liegenden Vertiefungen durch. Verwenden Sie für jede Verdünnung eine Mehrkanalpipette, um die Lösungen 5-10 Mal zu mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.

Nach Abschluss der seriellen Verdünnung werden die letzten 50 Mikroliter aus der letzten Vertiefung jeder Säule verworfen.

Zentrifugieren Sie die Platte 1 Minute lang mit 500 Umdrehungen pro Minute, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit an den Wänden der Vertiefung zurückbleibt. Berechnen Sie die Menge an DMEM, die erforderlich ist, um das SARS-CoV-2 PV zu verdünnen, wie im Textmanuskript beschrieben.

Mischen Sie die verdünnte PV-Lösung in einem Pipettenbecken und aliquotieren Sie 50 Mikroliter in jede Vertiefung, mit Ausnahme der Vertiefungen A6 bis A12, die die reine Zellkontrolle umfassen. Die Bohrungen A1 bis A6 dienen als reine PV-Steuerung.

Zentrifugieren Sie die Platte 1 Minute lang mit 500 Umdrehungen pro Minute, um sicherzustellen, dass keine Viren an den Wänden der Vertiefung zurückbleiben. Inkubieren Sie die Platten dann 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid, damit das Serum an das SARS-CoV-2-Glykoprotein binden kann.

Bereiten Sie als Nächstes eine Platte mit HEK 293T/17-Zielzellen vor, die 24 Stunden zuvor mit ACE2- und TMPRSS2-Plasmiden transfiziert wurden. Nehmen Sie das Nährmedium von der Platte und waschen Sie es zweimal mit 2 Millilitern PBS, indem Sie es auf eine Seite der Schale geben, um eine Zellablösung zu vermeiden.

Entsorgen Sie das PBS und geben Sie 2 Milliliter Trypsin auf die Platte. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator, bis sich die Zellen gelöst haben.

Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie 6 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin in die Platte, um die Trypsinaktivität zu unterdrücken und die Zellen sanft zu resuspendieren.

Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder durch Zählen des Objektträgers der Kammer. Geben Sie 1 x 10⁴ Zellen, aliquotiert in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern, in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden.

Entfernen Sie nach der Inkubation das Nährmedium aus allen Vertiefungen und fügen Sie 25 Mikroliter einer 1:1-Mischung aus PBS und einem kommerziellen Luciferase-Assay-Reagenz hinzu. Lesen Sie die Platte mit einem handelsüblichen Luciferase-Assay-System mit einem Mikrotiterplatten-Luminometer ab.

Berechnen Sie unter Verwendung der vom Luminometer erzeugten Rohdaten die IC50-neutralisierenden Antikörpertiter, wie im Textmanuskript beschrieben.