Messung des Immunglobulin-G-Spiegels im Vergleich zu einem Testimpfstoff in einem Mausserum

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die mit einem Testimpfstoff beschichtet ist, und blockieren Sie unspezifische Interaktionsstellen.

Entnehmen Sie eine Serumprobe von einer Maus, der der Testimpfstoff injiziert wurde.

Dieses Serum enthält Immunglobulin-G- oder IgG-Antikörper, die den Testimpfstoff erkennen.

Geben Sie in die mit Impfstoff beschichteten Vertiefungen seriell verdünnte Serumproben.

Die IgGs binden an den Impfstoff. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie Peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, die an IgGs binden. Entfernen Sie ungebundene Sekundärantikörper.

Fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu. Die Peroxidase interagiert mit dem Substrat und erzeugt ein blau gefärbtes Produkt.

Führen Sie eine Säure ein, um die Reaktion zu stoppen. Die Änderung des pH-Werts färbt die Lösung gelb.

Messen Sie mit einem Spektralphotometer die Farbintensität jeder Vertiefung, um die IgG-Konzentration in der Serumprobe zu bestimmen.

Für die Antigenbeschichtung des Enzyme-linked Immunosorbent Assay oder der ELISA-Platte verdünnen Sie das HI-Proteinantigen auf 10 Mikrogramm pro Milliliter mit der Beschichtungslösung und fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Antigens pro Vertiefung in die ELISA-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Platte nach der Inkubation mit 300 Mikrolitern PBST pro Vertiefung.

Verschließen Sie die Vertiefungen mit 300 Mikrolitern der Dichtungslösung pro Vertiefung für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie dann drei Mikroliter des Mäuseserums aus jeder Versuchsgruppe 100-mal, indem Sie 297 Mikroliter PBST hinzufügen, und wirbeln Sie das verdünnte Serum ein. Geben Sie für jede Serumprobe 100 Mikroliter verdünntes Serum pro Vertiefung in die beschichtete ELISA-Platte. In ähnlicher Weise verdünnen Sie die positiven und negativen Kontrollseren 100-mal mit PBST, indem Sie 4 Mikroliter Positiv- oder Negativkontrollserum zu 396 Mikrolitern PBST hinzufügen, gefolgt von einem Vortex-Mischen.

Um eine Verdünnung mit doppeltem Verhältnis durchzuführen, geben Sie 200 Mikroliter des zuvor verdünnten experimentellen Serums in die erste Reihe der beschichteten ELISA-Platte. Geben Sie dann 100 Mikroliter PBST in alle Vertiefungen, mit Ausnahme der Vertiefungen in den Reihen eins und 12. Stellen Sie dann die Pipettenpistole auf 100 Mikroliter ein und übertragen Sie 100 Mikroliter Serum von der ersten Reihe in die zweite Reihe, die PBST enthält.

Mischen Sie den Inhalt in der zweiten Reihe 10 Mal mit der Pipettenpistole. Führen Sie auf ähnliche Weise 1:2 aufeinanderfolgende Verdünnungen des Serums bis Reihe 11 durch. Wenn du fertig bist, wirf 100 Mikroliter Flüssigkeit aus Reihe 11 weg.

100 Mikroliter verdünntes negatives und positives Serum werden gemäß der Probenvorlage in jede entsprechende Vertiefung in Reihe 12 gegeben. Verschließen Sie die ELISA-Platte mit Frischhaltefolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit verdünnen Sie den Sekundärantikörper Anti-Maus-IgG HRP 10.000-mal durch Zugabe von PBST. Nach der einstündigen Inkubation waschen Sie die ELISA-Platte mit 300 Mikrolitern PBST pro Vertiefung, um die ungebundenen Antikörper zu reinigen. Geben Sie dann 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Platte mit 300 Mikrolitern PBST pro Mulde. Geben Sie dann 100 Mikroliter TMB-Farbentwicklungslösung in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 10 Minuten lang lichtgeschützt auf. Beenden Sie danach die Reaktion sofort mit 50 Mikrolitern 2 molare Schwefelsäure. Ermitteln Sie die optische Dichte oder die OD-Werte bei 450 Nanometern mit einem Enzymmarker innerhalb von 15 Minuten nach der Beendigung.