Ein Assay zur Messung der Akkumulation einer fluoreszierenden Antibiotikasonde in Bakterienzellen

Entnehmen Sie Analyseröhrchen mit Bakterienproben.

Fügen Sie in der Testprobe inhibitorische Moleküle hinzu, um die Antibiotika-Effluxpumpe der Bakterien zu blockieren.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antibiotikasonden hinzu, die in die Bakterienzellen eindringen.

In der Kontrollprobe extrudiert die Effluxpumpe die Sonden in das extrazelluläre Medium.

In der mit Inhibitoren behandelten Probe kann die blockierte Effluxpumpe die Sonden nicht ausstoßen, was zu ihrer Akkumulation führt.

Zentrifugieren Sie die Proben. Entsorgen Sie den Überstand mit extrazellulären Sonden.

Fügen Sie Lysepuffer gefolgt von Lysozym hinzu, um die bakterielle Zellwand zu schwächen.

Führen Sie Gefrier-Tau-Zyklen, Beschallung und Hochtemperatur-Exposition durch, um die Zellen zu lysieren.

Zentrifuge. Den Überstand auf eine Filtermembran übertragen.

Waschen und sammeln Sie das Filtrat, das die Sonden enthält.

Messen Sie die Fluoreszenzintensität des Filtrats.

Eine höhere Fluoreszenzintensität in inhibitorbehandelten Bakterienproben deutet auf einen Verlust der Effluxfunktion hin, was zu einer intrazellulären Sondenakkumulation führt.

Für die Analyse der Sondenakkumu