Ein Assay zur Messung der Akkumulation einer fluoreszierenden Antibiotikasonde in Bakterienzellen

Entnehmen Sie Analyseröhrchen mit Bakterienproben.

Fügen Sie in der Testprobe inhibitorische Moleküle hinzu, um die Antibiotika-Effluxpumpe der Bakterien zu blockieren.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antibiotikasonden hinzu, die in die Bakterienzellen eindringen.

In der Kontrollprobe extrudiert die Effluxpumpe die Sonden in das extrazelluläre Medium.

In der mit Inhibitoren behandelten Probe kann die blockierte Effluxpumpe die Sonden nicht ausstoßen, was zu ihrer Akkumulation führt.

Zentrifugieren Sie die Proben. Entsorgen Sie den Überstand mit extrazellulären Sonden.

Fügen Sie Lysepuffer gefolgt von Lysozym hinzu, um die bakterielle Zellwand zu schwächen.

Führen Sie Gefrier-Tau-Zyklen, Beschallung und Hochtemperatur-Exposition durch, um die Zellen zu lysieren.

Zentrifuge. Den Überstand auf eine Filtermembran übertragen.

Waschen und sammeln Sie das Filtrat, das die Sonden enthält.

Messen Sie die Fluoreszenzintensität des Filtrats.

Eine höhere Fluoreszenzintensität in inhibitorbehandelten Bakterienproben deutet auf einen Verlust der Effluxfunktion hin, was zu einer intrazellulären Sondenakkumulation führt.

Für die Analyse der Sondenakkumulation werden die Glycerinbestände der Bakterienstämme auf LB-Agarplatten gestrichen, um sie über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Am nächsten Morgen nehmen Sie eine einzelne Kolonie vom Teller und kultivieren sie über Nacht in Lysogenese-Brühe bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Übernachtkultur etwa 50-fach in frischem Medium.

Wenn die Kultur die mittlere Log-Phase erreicht, pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation und dekantieren Sie das Medium. Resuspendieren Sie die Bakterien in 1 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Bakterien erneut. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in PBS auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von zwei.

Fügen Sie 10,1 Mikroliter 10 Millimolar CCCP in PBS zu 1 Milliliter Bakterien hinzu und inkubieren Sie die Bakterien 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter einer 10 bis 100 Mikromol fluoreszierenden Antibiotikalösung in PBS.

Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius waschen Sie die Zellen viermal durch Zentrifugation in 1 Milliliter kaltem PBS pro Waschgang. Nach dem Waschen lysieren Sie die Bakterien mit 180 Mikrolitern Lysepuffer und 70 Mikrolitern Lysozym.

Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius frieren und tauen Sie die Bakterien dreimal bei minus 78 Grad Celsius für 5 Minuten bzw. 34 Grad Celsius für 15 Minuten ein. Nach der letzten Runde des Gefrierauftauens wird die Probe 20 Minuten lang besonnommen, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 65 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation wird die lysierte Probe durch Zentrifugation entnommen und der Röhrcheninhalt durch eine 10-Kilodalton-Filtermembran abgeseiht. Waschen Sie den Filter viermal mit 100 Mikrolitern Wasser pro Waschgang und aliquotieren Sie jeden Waschgang in einzelne Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie dann die Fluoreszenzintensität auf einem Platten-Reader mit Anregungs- und Emissionswellenlängen, die für das Fluorophor geeignet sind.