Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

0 Ansichten3:35 Min. • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit der intraperitonealen Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus.

Antigen-präsentierende Zellen (APCs) internalisieren das Glykolipid und präsentieren es über das nicht-klassische MHC-Molekül CD1d.

Die APCs wandern in die Milz und interagieren mit den invarianten natürlichen Killer-T-Zellen oder iNKT-Zellen, wodurch die Aktivierung und Proliferation der iNKT-Zellen induziert wird.

Ernte die Milz. Dissoziieren Sie es mechanisch, um eine einzellige Suspension zu erzeugen.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen. Fügen Sie ein Dichtegradientenmedium hinzu und zentrifugieren Sie, um die Lymphozyten zu trennen.

Sammeln Sie die Lymphozyten. Fügen Sie Glykolipid-Antigen-beladene Fluorophor-markierte CD1d-Tetramere hinzu, die mit den iNKT-Zellen interagieren.

Ungebundene Tetramere entfernen. Überlagerung mit magnetischen Mikrokügelchen, die an die tetramergebundenen Fluorophore binden.

Entfernen Sie die ungebundenen Kügelchen und laden Sie die Zellsuspension auf eine Magnetsäule.

Unter dem Magnetfeld werden die bead-gebundenen iNKT-Zellen in der Säule zurückgehalten, während die restlichen Zellen hindurchfließen.

Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld. Fügen Sie einen Elutionspuffer hinzu, um die iNKT-Zellen zu eluieren.

Injizieren Sie normaler DBA/1-Maus intraperitoneal Alpha-GalCer in einer Dosierung von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. Drei Tage nach der Modellierung, nach der Anästhesie, isolieren Sie die Milz der Maus. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie die Milz in einem 200-Maschen-Sieb schneiden und zerkleinern. Waschen Sie die Zellsuspension mit PBS. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 mal g und verwerfen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 Milliliter Vollblut und Gewebeverdünnungslösung. Fügen Sie 3 Milliliter Maus-Lymphozyten-Trennmedium hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen dann 20 Minuten lang bei 300-fachem g bei Raumtemperatur.

Um die iNKT-Zellen zu reinigen, resuspendieren Sie 10 bis 7 Zellen mit 100 Mikrolitern 4 Grad Celsius PBS. Fügen Sie 10 Mikroliter alpha-GalCer-beladenes CD1d Tetramer-PE hinzu und inkubieren Sie sie bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in 80 Mikrolitern PBS. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-PE-Mikrokügelchen hinzu und inkubieren Sie sie bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie sie zweimal mit PBS und resuspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern PBS.

Stellen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld des MACS-Sortierers und spülen Sie sie mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie die vorbereitete Zellsuspension in die Sortierkolonne, sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie dreimal mit PBS-Puffer. Entfernen Sie das Magnetfeld und geben Sie 1 Milliliter PBS-Puffer in die Sortierkolonne. Drücken Sie den Kolben schnell mit konstantem Druck, um die markierten Zellen in das Entnahmeröhrchen zu treiben und die gereinigten iNKT-Zellen zu erhalten. Zählen Sie mit einem automatischen Zellzähler.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026