JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 2:57 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Röhrchen mit in vitro transkribierten mRNAs, die für grün fluoreszierende Proteine kodieren.
Die mRNA enthält modifizierte Nukleotide, 5-Methyl-Cytidintriphosphat und Pseudouridintriphosphat, die die Immunantwort verhindern und die mRNA-Stabilität erhöhen.
Das 5'-Ende der mRNA ist dephosphoryliert, wodurch ihre Erkennung durch Mustererkennungsrezeptoren auf Makrophagen verhindert wird.
Fügen Sie der mRNA ein kationisches Transfektionsreagenz auf Lipidbasis hinzu, das die Verkapselung der mRNA durch elektrostatische Wechselwirkungen erleichtert und einen Komplex bildet.
Die Lipid-mRNA-Komplexe werden in eine Multi-Well-Platte mit adhärenten, von der Maus abgeleiteten Primärmakrophagen gegeben und für eine gleichmäßige Durchmischung vorsichtig gerührt.
Die Makrophagen internalisieren den mRNA-haltigen Komplex in ein Endosom. Später verschmilzt der Komplex mit der endosomalen Membran und setzt die mRNAs in das Zytoplasma der Zelle frei.
Der Poly-A-Schwanz am 3'-Ende stabilisiert die mRNA, die eine Proteinsynthese durchläuft, um grün fluoreszierende Proteine herzustellen.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop deutet die grüne Fluoreszenz innerhalb der Makrophagen auf ei
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