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Immunologie
0 Aufrufe • 5:23 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit menschlichen Nabelschnurblutzellen, einschließlich CD34+ hämatopoetischen Stammzellen oder HSCs.
Fügen Sie Antikörper hinzu, um zelluläre Fc-Rezeptoren zu blockieren und so eine unspezifische Bindung von HSC-spezifischen magnetischen Kügelchen zu verhindern.
Führen Sie die mit Antikörpern beschichteten magnetischen Kügelchen ein, die auf CD34+ HSCs abzielen. Zentrifugieren Sie und verwerfen Sie den Überstand.
Suspendieren Sie die Zellen in einem Puffer. Führen Sie sie durch einen magnetischen Abscheider, um perlengebundene HSCs zurückzuhalten. Ungebundene Zellen fließen hindurch.
Entfernen Sie das Magnetfeld, um die HSCs zu sammeln.
Zentrifugieren und resuspendieren Sie die Zellen in einem Wachstumsmedium. Die Zellen anrichten und inkubieren.
Das Medium enthält Wachstumsfaktoren und Zytokine, die das Überleben und die Expansion von HSC fördern.
Ernte die Zellen. Fügen Sie ein Gefriermedium hinzu, geben Sie es in ein Kryofläschchen und frieren Sie es ein.
Um ein Mausmodell für das menschliche Immunsystem (KIS) zu erzeugen, tauen Sie die HSCs auf und geben Sie sie in ein vorgewärmtes Medium.
Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem Puffer.
Die Zellen sind bereit für die Injektion in ein immundefizientes Maus-Welpen zur KIS-Modellgenerierung.
Zu Beginn resuspendieren Sie das aus Nabelschnurblut isolierte CD34-positive Zellpellet in 300 Mikrolitern magnetischem Zellseparatorpuffer pro 1 x 108 Zellen. Fügen Sie 100 Mikroliter FcR-Blockierungsreagenz pro 1 x 108 Zellen hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern CD34-positiven magnetischen Kügelchen pro 1 x 108 Zellen und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie 5 Milliliter magnetischen Zellseparatorpuffer pro 1 x 108 Zellen hinzu und drehen Sie bei 360 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Waschschritt und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern pro 100 Millionen Zellen magnetischem Zellseparatorpuffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift "unfraktioniert". Beschriften Sie zwei weitere 15-Milliliter-Röhrchen – CD34-negativ und CD34-positiv. Legen Sie die drei Röhrchen auf ein Kühlgitter.
Trennen Sie die Zellen mit dem zweispaltigen Positivauswahlprogramm auf einem automatischen magnetischen Zellseparator in einer Biosicherheitswerkbank. Als nächstes bereiten Sie zum Expandieren und Einfrieren von CD34-positiven menschlichen Stammzellen Nabelschnurblut oder CB-Medium vor, wie im Manuskript beschrieben, und passieren Sie einen 0,22-Mikron-Filter. Resuspendieren Sie die CD34-positiven Zellen bei 100.000 pro Milliliter CB-Medium und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.
Am dritten Tag wird dem Kolben das gleiche Volumen CB-Medium ohne Zytokine zugegeben. Ernten Sie am fünften Tag die expandierten CD34-positiven Zellen. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab und sammeln Sie sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie so viel CB-Medium hinzu, dass der Boden des Kolbens bedeckt ist. Kratzen Sie mit einem Zellschaber den gesamten Boden des Kolbens ab. Sammeln Sie alle Medien in demselben 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie.
Resuspendieren Sie die Zellen in 2 Millilitern CB-Medium und zentrifugieren Sie. Saugen Sie das Medium bis zum Pellet ab und resuspendieren Sie das Pellet in einem Gefriermedium. Beginnen Sie als Nächstes drei Stunden nach der Bestrahlung mit der CD34-positiven Zellvorbereitung. 10 Milliliter CB-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen erwärmen.
Entnehmen Sie jeweils vier bis sechs Welpen eine Durchstechflasche mit in vitro expandierten und gefrorenen CD34-positiven Zellen zur Injektion. Tauen Sie schnell bei 50 bis 55 Grad Celsius auf, bis nur noch eine kleine Menge Eis sichtbar ist, und geben Sie die Zellen in das erwärmte CB-Medium. Verwenden Sie 1 Milliliter Medium, um jedes Fläschchen zu spülen, und drehen Sie die Zellen 12 Minuten lang bei 360 g bei 4 Grad Celsius.
Saugen Sie das Medium vorsichtig an. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 Millilitern CB-Medium und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie erneut die Zellen, aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern sterilem PBS pro n plus 1 Welpen zur Injektion, was zu 250.000 bis 450.000 CD34-positiven Zellen pro Maus führt.