JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:44 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie zwei Elektroporationsküvetten. Eine Küvette enthält eine kleine interferierende RNA oder siRNA, die die Produktion von FIP200, einem Autophagie-induzierenden Protein, hemmen soll.
Die zweite Küvette enthält eine verschlüsselte siRNA als Kontrolle, die die FIP200-Produktion nicht hemmt.
Fügen Sie unreife dendritische Zellen oder iDCs hinzu, elektroporieren Sie für den zellulären Eintritt von siRNA und plattieren Sie dann die Zellen.
Die internalisierte siRNA bindet an einen RNA-induzierenden Silencing-Komplex.
Der Komplex mit der FIP200-spezifischen siRNA spaltet seine Ziel-mRNA und hemmt so die FIP200-Produktion, während die Kontroll-siRNA-behandelten iDCs FIP200 produzieren.
Ernten Sie die Zellen und fügen Sie das Herpes-simplex-Virus hinzu. Bei der Fusion der viralen Hüllzellmembran gelangt die freigesetzte DNA in den Zellkern und führt zur Produktion von viralen Proteinen und Nukleokapsiden.
Virale Proteine stören die Kernlamine. FIP200 bildet einen Komplex, der eine Signalkaskade auslöst, die Autophagie der gestörten Lamine induziert, um sie für den Abbau zu gewinnen, und die Flucht viraler Nukleokapside in das Zytoplasma erleichtert.
Die siRNA-vermittelte Hemmung der FIP200-Produktion schränkt die Lamin-Autophagie ein und verhindert so das Entweichen von Nukleokapsidn.
Die Zellen sind bereit, die siRNA-induzierte Autophagiehemmung zu bewerten.
Übertragen Sie am Tag 3,5 nach der Adhärenz 12 Millionen iDCs in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 mal g und verwerfen Sie dann den Überstand. Führen Sie parallel dazu eine durchflusszytometrische Analyse durch, um den Reifungsstatus zu überwachen.
Waschen Sie die iDCs vorsichtig in 5 Millilitern OptiMEM ohne Phenolrot und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern OptiMEM, wobei Sie die Zellkonzentration auf 6 Millionen Zellen pro 100 Mikroliter einstellen.
Geben Sie 75 Picamole entweder FIP200-spezifischer oder verschlüsselter siRNA in 4-Millimeter-Elektrodenküvetten und überführen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in die jeweilige Küvette. Pulsieren Sie die iDCs direkt mit einem Elektroporationsgerät.
Nach der Elektroporation werden die iDCs in Sechs-Well-Platten mit frischem, vorgewärmtem DC-Medium überführt, die Zellen mit einer Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter ausgesät und in den Inkubator gelegt. Untersuchen Sie nach 48 Stunden die Morphologie der elektroporierten iDCs mikroskopisch, ernten Sie die Zellen dann mit einem Zellschaber und überführen Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie die Vertiefungen mit 1 Milliliter PBS, ergänzt mit 0,01 % EDTA, und geben Sie die Lösung in die entsprechenden Röhrchen. Teilen Sie dann die Zellen für jede siRNA-Bedingung auf, wie im Manuskript beschrieben.
Verwenden Sie 500.000 Zellen, um den Reifungsstatus und die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Verwenden Sie 1 Million Zellen für die Western-Blot-Analyse, um die spezifische Knockdown-Effizienz von 200 zu überprüfen, und verwenden Sie die restlichen Zellen für HSV-1-Infektionsexperimente.