JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:42 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie retrovirale Vektoren, die mit primären Milzzellen gemischt sind.
Die Vektoren enthalten transgene RNA, die für einen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodiert, der auf ein tumorspezifisches Antigen abzielt.
Das Zytokin Interleukin-2 in den Medien fördert selektiv die Proliferation der T-Zellen, während die anderen Zellen schließlich absterben.
Übertragen Sie die Mischung auf eine Mikrotiterplatte, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist.
Zentrifugieren, um die Fibronektinfragmente zu erleichtern, die die Vektoren und T-Zellen binden, die Interaktion zwischen Virus und Wirtszelle zu vermitteln, und inkubieren.
Nach der Fusion der Hülle der Vektoren mit der Zellmembran transkribieren die viralen Enzyme die freigesetzte RNA in DNA und bauen sie in das Wirtsgenom ein.
Die transduzierten T-Zellen exprimieren oberflächengebundene CARs, die aus einem extrazellulären Antikörper-Variablenfragment bestehen, das auf das tumorspezifische Antigen abzielt, und intrazellulären Signalregionen, um auf das Antigen zu reagieren.
Resuspendieren Sie die Zellen, bevor Sie sie in ein Röhrchen übertragen.
Zentrifugieren Sie, um den Überstand mit nicht internalisierten Viren zu verwerfen, und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer für nachgeschaltete Assays.
Bereiten Sie am Tag nach der Splenektomie PBS mit 25 Mikrogramm pro Milliliter rekombinantem humanem Fibronektinfragment oder RHFF vor und beschichten Sie nicht mit Gewebekulturen behandelte 24-Well-Platten, indem Sie 0,5 Milliliter der Lösung in jede Vertiefung geben. Entfernen Sie am nächsten Tag die Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie 1 Milliliter 2% BSA in PBS pro Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann das BSA, indem Sie die Platte fest umdrehen, bevor Sie 2 Milliliter PBS zum Waschen hinzufügen. Nachdem Sie den Virusüberstand aus den HEK293T Zellen gesammelt haben, fügen Sie frisches TCM zu einem Endvolumen in Millilitern hinzu, das der Anzahl der RHFF-beschichteten Wells plus weiteren 3 Millilitern entspricht.
Nehmen Sie die kultivierten Splenozyten aus dem Inkubator und resuspendieren Sie sie, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes resuspendieren Sie die Splenozyten im Virusüberstand auf 1 x 106 Zellen pro Milliliter.
Geben Sie dann 1 Milliliter der Splenozytensuspension pro Vertiefung in die Vertiefungen der RHFF-beschichteten Platten. Drehen Sie nun die Platten 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius und 770 gs mit einer Beschleunigung von 4 und einer Pauseneinstellung von Null. Bereiten Sie während des Schleuderns 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL-2 in TCM vor.
Nach dem Schleudern 1 Milliliter des Mediums in jede Vertiefung der Platten geben und über Nacht inkubieren. Wenn T-Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, teilen Sie die Zellen, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab pipettieren und dann 1 Milliliter aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen, mit 24-Well-Gewebekultur behandelten Platte übertragen.
Geben Sie 1 Milliliter frisches TCM mit 50 internationalen Einheiten pro Milliliter IL-2 in jede Vertiefung. Wenn die Zellen nicht mehr als 80 % Konfluenz erreichen, wechseln Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie langsam 1 Milliliter Medium von der Oberseite jeder Vertiefung abpipettieren und durch 1 Milliliter frisches TCM ersetzen, das 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL-2 enthält.
Resuspendieren Sie CAR-T-Zellen, indem Sie in jeder Vertiefung dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Die Zellen bei 300 gs 10 Minuten lang drehen. Saugen Sie anschließend den Überstand vollständig an, ohne das Pellet zu stören. Verwenden Sie PBS, um die Zellen zu waschen, und zählen Sie sie dann, bevor Sie sie ein zweites Mal waschen. Eine typische Ausbeute an CAR-T-Zellen beträgt ca. 1 x 106 Zellen pro Well.