Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Beginnen Sie mit einer Suspension von T-Zellen und behandeln Sie sie mit CAR-Lentiviren, die ein Gen für den chimären Antigenrezeptor oder CAR- und CRISPR-Lentiviren tragen.

Das CRISPR-Lentivirus enthält Gene für die Guide-RNA und die Cas9-Nuklease sowie ein Antibiotikaresistenzgen.

Sowohl das CAR- als auch das CRISPR-Lentivirus interagieren mit T-Zellen und setzen deren RNA frei.

Diese RNAs werden rückwärts transkribiert und in entsprechende DNA umgewandelt, die sich in die T-Zell-DNA integriert.

Dies ermöglicht die Synthese von CAR-Proteinen, Guide-RNAs und Cas9-Proteinen.

Die Guide-RNA bildet mit Cas9 einen Komplex, der das Zielgen auf der T-Zell-DNA spezifisch erkennt und an es bindet.

In der Zwischenzeit spaltet Cas9 die DNA, wodurch ein doppelsträngiger Bruch entsteht.

Dieser Bruch wird durch nicht-homologe Endverbindung, einen fehleranfälligen Reparaturmechanismus, repariert, der zu einer Modifikation des Zielgens führt.

Dabei entstehen genetisch veränderte T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren.

Behandeln Sie die Zellen mit Antibiotika, um die unmodifizierten T-Zellen zu eliminieren und die genetisch veränderten CAR-T-Zellen selektiv zu isolieren.

Um den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor zu stören, verwenden Sie eine Leit-RNA, wie im Manuskript beschrieben. Transfektionsreagenzien 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie sie nach der Inkubation zu den 293T-Zellen hinzu, die eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreicht haben, und kultivieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % CO₂, um Lentivirus zu produzieren.

Nach 24 und 48 Stunden wird der virushaltige Überstand durch Ultrazentrifugation in 50-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen geerntet und konzentriert und für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren. Dann, am ersten Tag, suspendieren Sie die T-Zellen sanft wieder, um Rosetten aufzubrechen.

In einem BSL-2 plus-zugelassenen Labor wird den stimulierten T-Zellen das CAR19-Lentivirus und das GM-CSF-gerichtete CRISPR-Lentivirus zur Erzeugung von CAR-T-Zellen hinzugefügt. Am dritten und fünften Tag behandeln Sie bei erfolgreich transduzierten Lenti-CRISPR-editierten T-Zellen mit Puromycin-Resistenz Zellen mit Puromycin-Dihydrochlorid in einer Konzentration von 1 Mikrogramm Puromycin pro Milliliter.