JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:30 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie T-Zellen, die in einem Medium suspendiert sind, das für die Elektroporation geeignet ist, ein Prozess, bei dem elektrische Impulse temporäre Poren in der Zellmembran erzeugen.
Fügen Sie Komplexe hinzu, die ein Cas9-Protein und eine einzelne Guide-RNA oder sgRNA enthalten. sgRNA ist eine kleine RNA, die Cas9, eine molekulare Schere, zum Schneiden an eine bestimmte Stelle auf der DNA leitet.
Fügen Sie kurze einzelsträngige DNA-Moleküle hinzu, die den Transport der Cas9-sgRNA-Komplexe in die Zelle unterstützen.
Diese Mischung wird in eine Küvette überführt und durch kurze elektrische Impulse die Elektroporation eingeleitet.
Dieser Prozess ermöglicht es den Komplexen, in die Zelle einzudringen.
Die sgRNA bindet an die Zielstelle in der T-Zell-DNA, wodurch Cas9 die DNA bearbeiten kann, wodurch ein Bruch in beiden Strängen entsteht.
Diese Störung signalisiert den Reparaturproteinen an die Stelle.
Die Reparaturproteine verbinden dann die Enden wieder, wodurch das Gen funktionsunfähig wird.
Inkubieren Sie die geneditierten T-Zellen in einem geeigneten Medium für nachgelagerte Assays.
Bereiten Sie das Ribonukleoprotein oder den RNP-Komplex vor, indem Sie 10 Mikrogramm Cas9-Nuklease mit 5 Mikrogramm einfacher Guide-RNA 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie eine Mock-Kontrolle ohne einzelne Guide-RNA hinzu. Kombinieren Sie die resuspendierten T-Zellen mit dem RNP-Komplex und fügen Sie 4,2 Mikroliter 4 mikromolare Elektroporationsverstärker hinzu. Gut mischen und in Elektroporationsküvetten umfüllen.
Galvanisieren Sie die Zellen mit dem Impulscode EH-1-11. Inkubieren Sie dann 5 Millionen Zellen pro Milliliter in R-10, ergänzt mit fünf Nanogramm pro Milliliter humanem IL-7 und menschlichem Il-15 bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden in 12-Well-Platten. Fahren Sie nach der Inkubation mit der Aktivierung und Expansion der T-Zellen fort.