Generierung eines doppelt humanisierten BLT-Mausmodells (Knochenmark, Leber, Thymus)

Beginnen Sie mit einer anästhesierten, immungeschwächten Maus, der Immunzellen fehlen.

Behandeln Sie die Maus mit einer subletalen Dosis Röntgenstrahlen, um vorhandene Stammzellen aus dem Knochenmark zu eliminieren.

Präparieren Sie die Maus und bringen Sie Fragmente von Leber- und Thymusgewebe des menschlichen Fötus zwischen die Niere und ihre Kapsel.

Schließen Sie den Schnitt.

Das implantierte Leber- und Thymusgewebe wächst und bildet Organoide, bei denen es sich um Zellaggregate handelt, die einem Organ ähneln.

Nach der Genesung injizieren Sie humane hämatopoetische Stammzellen oder HSCs in die Schwanzvene.

Injizierte HSCs wandern in das Thymus-Organoid und das Knochenmark und differenzieren sich in verschiedene menschliche Immunzellen.

Stellen Sie der Maus mit Antibiotika angereichertes Wasser zur Verfügung, um vorhandene Darmmikroben abzutöten.

Führen Sie mit einem oralen Röhrchen menschliche fäkale Mikroben direkt in den Darm der Maus ein, um die mikrobielle Besiedlung zu fördern.

Das Ergebnis ist die Entwicklung eines doppelt humanisierten BLT-Mausmodells, das ein menschliches Immunsystem und Darmmikroben zeigt.

Um das Leber- und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren, setzen Sie zuerst die Maus in eine Haube. Behandeln Sie die Mäuse am Tag der Operation mit einer subletalen Ganzkörperbestrahlung mit einer Dosis von 12 Centi-Gray pro Gramm Körpergewicht. Rasieren Sie jede Maus um die linke laterale und mediale Seite, nachdem Sie einen angemessenen Sedierungsgrad bestätigt haben. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, bringen Sie bei Bedarf eine Ohrmarke an und desinfizieren Sie die Haut mit drei aufeinanderfolgenden Jod- und 70%igen Isopropanol-Peelings.

Wenn die Haut vorbereitet ist, laden Sie mit einer Pinzette ein 1 bis 1,6 Millimeter großes Fragment des menschlichen Lebergewebes des Fötus in einen Trokar, gefolgt von einem 1 bis 1,6 Millimeter großen Fragment des menschlichen fötalen Thymusgewebes. Verwenden Sie die Pinzette, um die Haut anzuheben, und verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Längsschnitt in die Haut zu machen. Verlängern Sie den Schnitt auf der linken Seite der Maus auf 1,5 bis 2 Zentimeter und heben Sie die Muskelschicht mit einer Pinzette an. Öffnen Sie die Muskelschicht mit einer Schere in Längsrichtung, verlängern Sie den Schnitt nach Bedarf, um die Niere freizulegen, und greifen Sie sanft nach dem Fettgewebe, das die Niere umgibt.

Machen Sie mit einem Skalpell einen 1 bis 2 Millimeter großen Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel und führen Sie den vorgespannten Trokar langsam parallel zur Längsachse der Niere in den Schnitt ein. Lösen Sie das Gewebe zwischen der Nierenkapsel und der Niere und bringen Sie die Niere und den Darm wieder in ihre normale Position. Verwenden Sie dann Nähte, um die Muskelschicht zu schließen, und chirurgische Klammern, um die Haut zu schließen. Platzieren Sie die Maus in einem autoklavierten Mikroisolatorkäfig mit Überwachung, bis sie vollständig liegt. Sechs Stunden nach der Operation legen Sie die Mäuse unter eine Wärmelampe und desinfizieren Sie die Mäuse mit 70% Isopropanol.

Injizieren Sie 1,5 bis 5 x 5 x 10⁵ CD34-positives humanes fetales Lebergewebe, isolierte hämatopoetische Stammzellen in 200 Mikrolitern PBS, in eine erweiterte Schwanzvene pro Tier. Stoppen Sie dann die Blutung mit sanftem Druck und bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück. 9 bis 12 Wochen nach der Operation verwenden Sie eine Kegelfessel aus Kunststoff, um ein Bein einer humanisierten Maus zu isolieren, und besprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70 % Isopropanol. Verteilen Sie antibiotische und schmerzlindernde Salbe auf der Entnahmestelle.

Punktieren Sie mit einer 25-Gauge-Nadel, die in einem 90-Grad-Winkel gehalten wird, die Stammvene, um 50 bis 100 Mikroliter Blut in ein EDTA-beschichtetes Blutentnahmeröhrchen zu sammeln. Wenn ein geeignetes Blutvolumen erhalten wurde, üben Sie mit dem sterilen Stück Gaze Druck auf die Stelle aus, um die Blutung zu stoppen, bevor Sie die Maus in ihren Käfig zurückbringen. Verwenden Sie dann die entnommene periphere Blutprobe, um den Grad der Rekonstitution menschlicher Immunzellen durch Durchflusszytometrie zu beurteilen, wobei Antikörper gegen humane CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 und Maus-CD45 verwendet werden.

Für die Entnahme frischer Kotproben legen Sie einzelne autoklavierte Papiertüten in einen Abzug und stecken Sie eine Maus in jeden Beutel, bis jedes Tier seinen Stuhlgang verrichtet. Bringen Sie dann die Mäuse in ihren Käfig zurück und übertragen Sie jede Kotprobe mit einer sterilen Pinzette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Maus für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Am Ende der 14-tägigen Antibiotikabehandlung wechseln Sie das Trinkwasser in autoklaviertes sterilisiertes Wasser und bringen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavierten Käfig. 24 und 48 Stunden nach Beendigung der Antibiotika füllen Sie ordnungsgemäß vorbereitete Quellen von fäkalem Mikrobiota-Transplantatmaterial und aliquotieren Sie die Proben in einer anaeroben Kammer unter anaeroben Bedingungen.

Um eine Stuhltransplantation durchzuführen, geben Sie jedem Versuchstier 200 Mikroliter fäkales Mikrobiota-Transplantatmaterial über eine orale Sonde und verteilen Sie das verbleibende aufgetaute Material auf dem Fell der humanisierten Mäuse oder auf der Käfigeinstreu.