Eine Technik zur Gen-Editierung in natürlichen Killerzellen mit CRISPR Cas9

Nehmen Sie eine Mischung aus einer CRISPR-RNA oder crRNA und einer trans-aktivierenden crRNA oder tracrRNA.

Erhitzen Sie die Mischung und lassen Sie sie abkühlen, um die Basenpaarung von tracrRNA mit crRNA zu einer Leit-RNA oder gRNA zu erleichtern.

Fügen Sie eine molekulare Schere hinzu, die Cas9-Enzyme genannt werden, die an die gRNA binden und Komplexe bilden.

Fügen Sie die Cas9-gRNA-Komplexe zu natürlichen Killer- oder NK-Zellen hinzu, die in einer Elektroporationslösung suspendiert sind.

Einführung einzelsträngiger DNA-Moleküle, die beim Transport von Cas9-gRNA-Komplexen helfen.

Übertragen Sie die Mischung in eine Küvette und führen Sie eine Elektroporation durch, wobei temporäre Poren in der Membran entstehen, durch die die Komplexe in die Zelle gelangen können.

Die gRNA bindet an die Zielstelle im Genom, wodurch Cas9 die DNA spalten kann.

Reparaturproteine binden an der Bruchstelle und verbinden sich mit der DNA, was häufig zu Einfüge- oder Deletionsfehlern bei Basenpaaren führt. Die daraus resultierende Modifikation stört das Zielgen und macht es funktionsunfähig.

Übertragen Sie die gentechnisch veränderten Zellen zur weiteren Analyse auf ein geeignetes Medium.

Am Tag der Elektroporation wird ein T25-Kolben mit 8 Millilitern frischem Nährmedium gefüllt, das mit 100 I.E. pro Milliliter IL-2 pro Versuchszellbedingung ergänzt wird, und die Kolben in einen befeuchteten 37 Grad_Celsius und 5 % CO 2 -Inkubator gestellt.

Während das Medium sich ausgleicht, fügen Sie 3 bis 4 x 10⁶ Zellen pro Bedingung pro 26 Mikroliter Transduktionsmischung in ein konisches Röhrchen hinzu und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie dann die Zellen dreimal in 12 Millilitern sterilem PBS pro Waschgang, um das gesamte FBS aus den Zellsuspensionen zu entfernen.

Während die Zellen gewaschen werden, resuspendieren Sie jede CRISPR-RNA und Tracer-RNA auf 200 mikromolare Endkonzentrationen. Mischen Sie 2,2 Mikroliter jeder CRISPR-RNA mit einem 200-Mikromol-Volumen Tracer-RNA pro Probe und erhitzen Sie die Proben 5 Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Lassen Sie die Proben dann auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie die CRISPR-RNA-Tracer-RNA-Komplexe bis zu ihrer Verwendung bei minus 20 Grad Celsius.

Um die Ribonukleoproteinkomplexe zu bilden, fügen Sie Cas9-Endonuklease zu dem entsprechenden CRISPR-RNA-Tracer-RNA-Komplex hinzu, indem Sie über 30 bis 60 Sekunden schwenken, und inkubieren Sie die resultierenden Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten.

Nach der letzten Wäsche fügen Sie das gesamte Volumen des Elektroporationszusatzes aus dem Nukleofektorlösung P3-Kit hinzu und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 20 Mikrolitern der P3-Primärlösung 4D-Nukleofektor, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen.

Geben Sie sofort 5 Mikroliter jedes Ribonukleoproteinkomplexes in die entsprechende Zellsuspension und fügen Sie 1 Mikroliter 100 mikromolare Cas9-Elektroporationsverstärker zum Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex-Zellmix hinzu. Übertragen Sie 26 Mikroliter der Cas9-Ribonukleoprotein-Zelllösung in einzelne Vertiefungen eines Nukleokuvettenstreifens und klopfen Sie vorsichtig auf den Streifen, um sicherzustellen, dass die Proben den Boden jeder Vertiefung bedecken.

Starten Sie dann das Programm EN-138 des 4D-Nukleofector Systems. Lassen Sie die Zellen am Ende der Transduktion drei Minuten ruhen. Geben Sie dann 80 Mikroliter des voräquilibrierten Kulturmediums in jede Küvette und überführen Sie die Proben vorsichtig in einen Kolben pro Bedingung bei 37 Grad Celsius Inkubation.