JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:58 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit bidirektionalen Plasmiden, die cDNA tragen, die für bestimmte virale essentielle Proteine eines kälteadaptierten Influenzastamms kodieren.
Einführung eines neuen Satzes bidirektionaler Plasmide, die Hämagglutinin und modifizierte Neuraminidase-cDNA aus einem anderen Influenzastamm enthalten.
Geben Sie ein Transfektionsreagenz in diese Mischung und inkubieren Sie, um einen Komplex mit den Plasmiden zu bilden.
Übertragen Sie diese Komplexe auf kultivierte humane epithelähnliche Zellen, um den Eintritt von Plasmiden in die Zelle zu ermöglichen.
Die bidirektionalen Plasmide mit zwei Promotoren in entgegengesetzter Ausrichtung ermöglichen die Herstellung von viralen Proteinen und ihrer entsprechenden RNA
.Inkubieren Sie die Zellen bei einer niedrigeren Temperatur.
Die viralen Proteine und die viralen RNAs assemblieren sich selbst zu kälteadaptierten rekombinanten Influenzaviren mit reduzierter Replikation unter wärmeren Bedingungen.
Overlay mit Sialinsäure-überexprimierenden MDCK-Zellen und modifizierten Trypsin-Enzymen, die die Anheftung und den Eintritt von Viren in Zellen ermöglichen.
Inkubieren Sie bei der gleichen Temperatur, um die Replikation und Produktion neuer Viren zu induzieren.
Zentrifugieren und ernten Sie die rekombinanten abgeschwächten Lebend-Influenzaviren für eine Impfstoffvorbereitung.
Zu Beginn wird eine Million 293T-Zellen in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte mit DMEM beschichtet, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Streptokokken enthält. Bereiten Sie als Nächstes genügend Plasmid-Transfektionsmischung für 100 Mikroliter pro Vertiefung vor. Kombinieren Sie ein Mikrogramm jedes Plasmids und füllen Sie das Röhrchen mit vorgewärmtem Opti-MEM-Zellmedium auf 50 Mikroliter. In ein anderes Röhrchen geben Sie das doppelte Volumen an Lipofectamin 2000, das der Gesamtmenge des zu transfizierenden Plasmids entspricht, und füllen Sie das Röhrchen auf 50 Mikroliter mit Opti-MEM auf.
Bevor Sie die Transfektionsmischung in die Zellen geben, lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte für 16 Stunden in einen Inkubator. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium auf DMEM mit 0,3 % BSA und 1 % Stift-Streptokokken. Dann. Bewegen Sie die Zellen fünf Stunden lang mit 5 % Kohlendioxid auf 33 Grad Celsius.
Nach fünf Stunden fügen Sie ein Overlay von einer Million Influenza-permissiven MDCK-Zellen in Trypsin-supplementiertem DMEM hinzu. Bewahren Sie die Co-Kulturen 2 bis 3 Tage lang unter dem Inkubationsregime von 33 Grad Celsius auf, um das Virus zu erzeugen und zu amplifizieren. Später räumst du den Schmutz mit einer fünfminütigen Drehung von 260 g weg und sammelst dann die Überstände ein.