Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist, und fügen Sie aktivierte murine CD8-positive T-Zellen hinzu.

Einführung retroviraler Vektoren, die eine transgene RNA enthalten, die für einen chimären Antigenrezeptor oder CAR kodiert.

Decken Sie die Platte ab und verschließen Sie sie in einem Beutel, um eine Kontamination zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Platte mit niedriger Geschwindigkeit, um die Interaktion zwischen Virus und Zellen zu erleichtern.

Fibronektin bindet an das Virus und die Zelle und kolokalisiert sie, um den virusvermittelten Gentransfer zu verbessern.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation den versiegelten Beutel und inkubieren Sie die Platte unter physiologischen Bedingungen.

Die Hülle des viralen Vektors verschmilzt mit der Zellmembran und setzt die virale RNA und die Enzyme frei.

Die viralen Enzyme transkribieren die freigesetzte RNA rückwärts und integrieren die resultierende DNA in das Wirtsgenom, wodurch die Zellen oberflächengebundene CARs exprimieren können.

Das CAR besteht aus einer Antigen-Bindungsdomäne, die spezifisch für das Zielantigen ist, und Signaldomänen für die T-Zell-Aktivierung.

Die antigenspezifischen CAR-T-Zellen sind bereit für nachgelagerte Assays.

Bereiten Sie an Tag 1 mit menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platten vor, indem Sie 0,5 Milliliter Fibronektin in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte geben und über Nacht bei 4 Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie am nächsten Tag die Fibronektinlösung und fügen Sie 1 Milliliter 2% BSA in PBS pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie die behandelten Vertiefungen mit 1 Milliliter sterilem PBS. Die Platte ist nach dem Entfernen der Waschlösung gebrauchsfertig.

Zählen Sie die aktivierten CD8-T-Zellen mit Trypanblau. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation und resuspendieren Sie sie bei 5 Millionen lebensfähigen Zellen pro Milliliter für die Transduktion. Geben Sie 100 Mikroliter der aktivierten CD8-Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Fibronektin beschichteten Platte. Fügen Sie dann 1,5 bis 2 Milliliter des zuvor vorbereiteten virushaltigen Mediums hinzu und mischen Sie mit einer wirbelnden Bewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Verschließen Sie die Platte in einem Zip-Lock-Beutel und zentrifugieren Sie sie bei 2000 mal g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge und bringen Sie sie in eine biologische Sicherheitswerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Platte nicht mit Medium verunreinigt ist. Übertragen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator.

Entfernen Sie nach 4 Stunden 1 Milliliter Medium aus jeder Vertiefung. Ersetzen Sie es durch 1 Milliliter vorgewärmtes vollständiges T-Zell-Medium und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.