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Immunologie
0 Aufrufe • 2:43 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer gefrorenen Polymerlösung, die positiv geladene Polymere enthält.
Tauen Sie die Polymerlösung auf, bis sie Raumtemperatur erreicht.
Fügen Sie einen Puffer und einen Wirbel hinzu, um eine gleichmäßige Mischung zu erzielen, wodurch eine homogene Lösung entsteht.
Führen Sie die Ziel-mRNA in der Polymerlösung im gleichen Verhältnis ein, um eine optimale Reaktion zu erzielen.
Inkubieren, damit die positiv geladenen Polymere über elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Phosphatgruppen in der mRNA interagieren können.
Dies erleichtert den Einbau der mRNA in die Polymerstruktur, wodurch Nanopartikel aus mRNA-Polymer-Komplexen oder Polyplexen gebildet werden.
Übertragen Sie diese Polyplexe in ein Röhrchen mit RNase-freiem Wasser.
Mischen Sie sie und lassen Sie die Ausfällung der Polyplexe zu.
Geben Sie einen Puffer mit Saccharose ein und frieren Sie ihn ein. Saccharose wirkt als Kryoprotektivum, das die strukturelle Integrität der Polyplexe aufrechterhält.
Führen Sie dann eine Gefriertrocknung durch, um alle Wasserspuren zu entfernen.
Lagern Sie es bei niedriger Temperatur als mRNA-Impfstoffkandidat für die zukünftige Verwendung.
Für die Polyplexbildung tauen Sie die zuvor vorbereiteten Polymere C-6-Peptid-Poly-Beta-Aminoester auf und wirbeln Sie die Lösung vortexen. Bereiten Sie nach dem Auf- und Abpipettieren des Polymers eine 12,5-millimolare Lösung in Natriumacetat vor. Wirbeln Sie die Lösung vor und warten Sie 10 Minuten.
Bereiten Sie anschließend mRNA mit 0,5 Milligramm pro Milliliter vor und mischen Sie sie durch Pipettieren. Wirbeln Sie die Polymerlösung erneut ein. Mischen Sie dann die Lösung des genetischen Materials in der Polymerlösung im Verhältnis eins zu eins in einem Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einem thermischen Block. Nach der Inkubation fällt die Mischung mit ein bis zwei RNase-freiem Wasser aus, indem Sie die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben, das das Wasser enthält.
Um dann die Hilfsstoffe einzubeziehen, fügen Sie 20 millimolare HEPES und 4 % Saccharoselösung im gleichen Volumen wie die Mischung aus mRNA und Poly-Beta-Aminoestern hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Für die Lyophilisierung führen Sie nach dem Einfrieren der Polyplexlösung bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde die Primärtrocknung durch und lagern Sie die Polyplexe sofort bei minus 20 Grad Celsius, um eine Rehydrierung zu vermeiden.