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Beginnen Sie mit einer Knochenmarkstammzellkultur.
Führen Sie den Trypsin-EDTA-Puffer ein, um die Zellen abzulösen und die Zellklumpen aufzubrechen, wodurch eine einzellige Suspension entsteht.
Zentrifuge, dann den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet mit einem frischen Medium.
Übertragen Sie die Suspension in eine Spritze und verbinden Sie sie mit einer Membranfiltereinheit.
Drücken Sie den Kolben und entsorgen Sie das filtrathaltige Medium.
Nehmen Sie den Filter ab. Füllen Sie die Spritze mit einem frischen Medium. Schließen Sie den Filter wieder an und drücken Sie schnell auf den Kolben.
Durch den Druck der Flüssigkeit wird die Zelle in Richtung der Filterporen gedrückt.
Dabei entsteht ein kugelförmiges Plasmamembran-Vesikel, kurz PMV.
Diese Vesikel enthalten Zellbestandteile und Organellen, die von der Membran umgeben sind.
Untersuchen Sie das Filtrat unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop, um durchscheinende kugelförmige Vesikel zu beobachten.
Die Abmessungen der Vesikel stimmen mit der Porengröße der Filtermembran überein, was die Bildung von PMVs bestätigt.
Um die PMVs zu erzeugen, wurden zunächst Maus-PMSCs in vollständigem DMEM-Kulturmedium in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, spülen Sie die Vertiefung mit 0,5 Millilitern kalziumfreiem PBS und lösen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA ab.
Nach drei Minuten bei 37 Grad Celsius klopfen Sie einige Male mit der Handfläche auf die Platte, um die Zelldissoziation zu erleichtern und die Verdauung mit 1 Milliliter Nährmedium zu stoppen. Die Zellen werden zur Zentrifugation in ein konisches 5-Milliliter-Röhrchen überführt und das Pellet in 4 Millilitern frischem Kulturmedium resuspendiert. Teilen Sie dann die Zellen auf zwei Vertiefungen einer neuen Sechs-Well-Platte auf und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in den Zellkultur-Inkubator.
Ernten Sie am nächsten Tag die Zellen aus einer Vertiefung durch Trypsinaufschluss, wie gerade gezeigt, und resuspendieren Sie das Pellet in 0,5 Millilitern frischem Kulturmedium nach der Entnahme durch Zentrifugation. Laden Sie die Zellen in eine 1-Milliliter-Insulinspritze und befestigen Sie die Spritze an einer Filtereinheit. Drücken Sie schnell auf den Kolben, um die Zellen durch den Filter zu drücken, und entsorgen Sie das extrudierte Medium. Laden und dosieren Sie dann 0,5 Milliliter zusätzliches Kulturmedium durch den Filter, wie gerade gezeigt, und sammeln Sie das Medium aus der zweiten Extrusion.
Säen Sie 150 Mikroliter des gesammelten Mediums in eine 35-Milliliter-Glasbodenschale und lassen Sie die Vesikel etwa 10 Minuten lang ruhen. Bestätigen Sie dann das Vorhandensein von PMVs unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, unter Verwendung eines 20-fachen Objektivs.