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Immunologie
0 Ansichten • 4:21 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir einen murinen Melanomtumor, der tumorassoziierte Neutrophile (TANs) umfasst.
TANs weisen eine erhöhte Aktivität des Enzyms Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT) auf, das die Angiogenese, die Proliferation von Blutgefäßen in Tumoren und das Tumorwachstum stimuliert.
Zerkleinern Sie das Gewebe und fügen Sie Enzyme hinzu, um die Gewebematrix abzubauen und die Zellen zu lockern.
Filtern Sie die Suspension durch ein Sieb und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren.
Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, zentrifugieren Sie dann und verwerfen Sie den Überstand mit den Zelltrümmern.
Einführung von Antikörpern zur Blockierung zellulärer Fc-Rezeptoren, wodurch unspezifische Immunfärbung vermieden wird.
Einführung eines Fluorophor-markierten Antikörpercocktails, der spezifisch für Oberflächenmarker auf TANs ist, und eines Farbstoffs zur Unterscheidung toter Zellen.
Isolieren Sie mit FACS die mit Fluorophoren markierten lebensfähigen TANs und übertragen Sie sie auf eine Mikroplatte.
Fügen Sie ausgewählten Wells einen Inhibitor hinzu, der die NAMPT-Aktivität blockiert, und inkubieren Sie.
Verwenden Sie die Zellen, um ihre Angiogenese-stimulierende Kapazität zu beurteilen. Die mit Inhibitoren behandelten TANs zeigen eine verminderte Angiogenese im Vergleich zu den unbehandelten TANs.
Für die tumorassoziierte Neutrophilenisolierung werden fünf Tumoren pro Vertiefung in einzelne Vertiefungen einer sterilen Sechs-Well-Platte gelegt, während sie entnommen werden, und mit einer sterilen Schere die Tumoren in 2 bis 3 Millimeter große Stücke zerkleinert. Als nächstes verdauen Sie die Tumorfragmente mit 1 Milliliter scheibenbasierter Kollagenase, DNase I-Lösung für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit Feuchtigkeit und mischen Sie die Proben alle 15 Minuten mit einer 10-Milliliter-Spritze.
Am Ende der Inkubation filtrieren Sie die Zellen durch 100-Mikrometer-Siebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen pro Vertiefung, um die unverdauten Fasern zu entfernen, und fügen Sie PBS bis zu einem Endvolumen von 15 Millilitern hinzu. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation und lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 1 Milliliter Lysepuffer pro Röhrchen.
Nach dem Mischen den Inhalt jedes Röhrchens in ein einzelnes 15-Milliliter-Röhrchen mischen und die Reaktion nach zwei Minuten mit 11 Millilitern des vollständigen Mediums von 4 Grad Celsius stoppen. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter PBBS und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit drei Mikrolitern FC-blockiertem Antikörper für 15 Minuten auf Eis.
Am Ende der Inkubation markieren Sie die Zellen mit Anti-CD11b- und Ly6G-Antikörpern und allen anderen Antikörpern von Interesse sowie DAPI für eine 30-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in 14 Millilitern PBS und resuspendieren Sie die Pellets bei einer Konzentration von 1 x 107 Zellen pro Milliliter frischem vollständigem Medium auf Eis.
Sortieren Sie dann die CD11b-positiven Ly6G-hohen DAPI-negativen Neutrophilen auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer gemäß den Standardsortierprotokollen und überprüfen Sie am Ende der Sortierung die Reinheit der isolierten Neutrophilen auf dem Durchflusszytometer. Für die In-vitro-Tumor-assoziierte Neutrophilenhemmung säen Sie 1,5 mal 10 bis zur fünften sortierten Neutrophilen in jede der beiden Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte und fügen Sie FK866 zu einer Endkonzentration von 100 Nanomolar in vollständigem Medium in eine Vertiefung und ein gleiches Volumen des vollständigen Mediums allein in die andere Vertiefung hinzu. Nach zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie die Pellets in PBS in der entsprechenden Konzentration für die nachfolgende Injektion.