JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:12 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Suspension von Mycobacterium bovis BCG, die mit einem nichtionischen Tensid behandelt wurde, um bakterielle Verklumpungen zu verhindern.
Als nächstes fügen Sie ein Biotinylierungsreagenz hinzu und inkubieren.
Dieses Biotinylierungsreagenz, ein Komplex aus Biotin, der mit einem funktionellen Linker komplexiert ist, erleichtert die Bindung von Biotinmolekülen an bakterielle Oberflächenproteine und die Markierung von Bakterien.
Nach der Inkubation die mit Biotin markierte Bakteriensuspension zentrifugieren, um das nicht umgesetzte Biotinylierungsreagenz zu entfernen.
Resuspendieren Sie die Bakterien in einem Puffer. Es wird eine Lösung des Avidin-Fusionsproteins hinzugefügt, eines rekombinanten Proteins, das eine Zielantigendomäne umfasst, die mit monomerem Avidin fusioniert ist.
Während der Inkubation bindet Avidin an Biotin und erleichtert so die bakterielle Oberflächenmodifikation mit Zielantigenen.
Die Suspension wird zentrifugiert, um ungebundene Fusionsproteine zu entfernen.
Resuspendieren Sie die antigenbeschichteten Bakterien in einem Puffer, der ein nichtionisches Tensid enthält. Die Antigenbeschichtung auf den Bakterien kann ihre Eigenschaft verbessern, Immunreaktionen auszulösen.
Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank mit persönlicher Schutzausrüstung, da BCG ein Krankheitserreger der Stufe II ist.
Um die Oberfläche von BCG-Zellen zu biotinylieren, züchten Sie die Zellen zunächst auf einer Shaker-Plattform auf die richtige Dichte. Sammeln Sie etwa 1 Milliarde Zellen und waschen Sie sie dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem, endotoxinfreiem PBST. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie sie in sterilem, endotoxinfreiem PBS. Bereiten Sie anschließend frisches 10-millimolares Sulfo-NHS SS-Biotin in steril gefiltertem Wasser zu. Inkubieren Sie dann die Bakterien in 1 Milliliter Brühe, die 0,5 Millimolar Sulfo-NHS SS-Biotin enthält. Führen Sie die Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch.
Waschen Sie anschließend die nun markierten Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST, um das nicht umgesetzte Reagenz zu entfernen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter PBST.
Mischen Sie 500 Millionen biotinylierte BCGs mit Avidin Fusion Protein, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm Protein pro Milliliter zu erreichen. Lassen Sie diese Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker ablaufen. Anschließend waschen Sie die Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST.