Generierung einzelner positiver CD8-T-Zellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Kulturinduzierte pluripotente Stammzellen auf einer Feeder-Schicht aus Stromazellen auf einer Gelatinematrix.

Die Feeder-Schicht ahmt die natürliche extrazelluläre Umgebung nach und leitet die Differenzierung der Stammzellen in kuppelförmige Organoide, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthalten.

Fügen Sie Enzyme hinzu, um die co-kultivierten Zellen zu dissoziieren.

Übertragen Sie die Zellen in eine frische, mit Gelatine überzogene Schale, um die Adhäsion der Stromazellen zu gewährleisten.

Sammeln Sie die nicht adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium.

Kulturieren Sie sie auf einer frischen Feeder-Schicht, um die Differenzierung der Vorläuferzellen in doppelt positive T-Zellen mit CD4- und CD8-Rezeptoren und doppelt-negative T-Zellen ohne beide Rezeptoren zu fördern.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen. Inkubieren Sie sie mit magnetischen Kügelchen mit CD4-spezifischen Antikörpern, die die doppelt-positiven T-Zellen selektiv markieren.

Verwenden Sie einen Magnetabscheider, um die doppelt positiven Zellen zu isolieren und auf einer frischen Feeder-Schicht zu kultivieren.

Ergänzen Sie mit einer Mischung aus Zytokinen und Antikörpern, um die Zellen zu stimulieren, die Herunterregulierung des CD4-Rezeptors zu induzieren und ihre Differenzierung in CD8-einzelne positive Zellen zu fördern.

Bereiten Sie gelatinierte OP9-delta-1-Gerichte eine Woche vor der Co-Kultur mit humanen IPSCs zu. Geben Sie 4 Milliliter 0,1 % Gelatine in drei neue Zellkulturschalen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Gelatine aspirieren und 8 Milliliter OP9-Medium in jede Schale geben. Eine konfluente Schale mit OP9-delta-1-Zellen wird in drei mit Gelatine überzogene Schalen geleitet.

Geben Sie nach vier Tagen 10 Milliliter OP9-Medien in jede Zellschale, um insgesamt 20 Milliliter Medien pro Schale zu erhalten. Beginnen Sie sieben bis acht Tage nach dem Passieren der Zellen mit der IPSC-Co-Kultur an OP9-Delta-1-Konfluenzschalen. Aspirieren Sie das Medium aus einer konfluenten Schale menschlicher IPSCs und fügen Sie 10 Milliliter OP9-Medium hinzu.

Schneiden und lösen Sie Zellkolonien mit einem Einweg-Zellpassierwerkzeug ab und geben Sie 350 bis 600 Klumpen geschnittener Kolonien in eine vorgelatinierte OP9-delta-1-Schale mit 10 Millilitern frischem OP9-Medium. Schaukeln Sie die Kulturschale von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Bienenvölker zu gewährleisten. Aspirieren Sie am nächsten Tag das verbrauchte Medium und ersetzen Sie es durch 20 Milliliter frisches OP9-Medium.

Die humanen IPSC-Klumpen, die einen Tag lang auf OP9-delta-1 cokultiviert wurden, sollten als kleine, runde Monolayer-Kolonien erscheinen. An Tag 5 aspirieren Sie 10 Milliliter verbrauchtes Medium und fügen Sie 10 Milliliter frisches OP9-Medium hinzu. Die Kolonien beginnen sich in primitives Mesoderm zu differenzieren, das durch ein mehrschichtiges dunkles Zentrum gekennzeichnet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an Tag 9, dann entwickeln sich die mehrschichtigen Zentrumsstrukturen zu kuppelartigen Formen. Ernten Sie die hämatopoetischen Vorläuferzellen am Tag 13, wobei die Strukturen aus einem dunklen zentralen Organoid bestehen, das von einem Netzwerk kuppelartiger Bereiche umgeben ist. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 5 Millilitern 1x phenolrotfreier Hank's ausgewogener Salzlösung mit Calcium und Magnesium oder HBSS.

Fügen Sie nach dem Waschen 250 Mikroliter mit 5.000 Einheiten pro Milliliter Kollagenase-4 bis 10 Milliliter HBSS hinzu. Geben Sie die Mischung in die Zellen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Aspirieren Sie das HBSS-Kollagenase-Gemisch und waschen Sie die Zellen einmal mit 5 Millilitern PBS. Nach dem Waschen mit PBS 5 Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA hinzufügen und die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie dann 4 Milliliter OP9-Medium hinzu und assoziieren Sie die Zellschicht durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 mal g und 4 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern OP9-Medien.

Die Zellsuspension auf eine neue, gelatinierte 10-Zentimeter-Zellkulturschale legen und 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sammeln Sie dann alle nicht anhaftenden Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Die Zellsuspension wird durch ein Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und wie zuvor beschrieben zentrifugiert. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern Differenzierungsmedium.

Plattieren Sie die Zellsuspension auf eine neue konfluente OP9-Delta-1-Schale. Passieren Sie die Zellen am 16. Tag gemäß den Anweisungen des Manuskripts und setzen Sie die Passage der nicht adhärenten Zellen danach alle fünf bis sieben Tage fort. Nach 35 Tagen der Differenzierung reichern Sie die CD4-positive Zellpopulation durch CD4-Magnetbeadisolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers an.

Resuspendieren Sie dann die Zellen in OP9-Medien und geben Sie 1 Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit flachem Boden und 24 Vertiefungen mit konfluentem OP9-delta-1. Stimulieren Sie die Zellen, indem Sie 100 internationale Einheiten humanes IL-2, 5 Nanogramm humanes IL-7, 500 Nanogramm Anti-Human-CD3-Antikörper und 2 Mikrogramm Anti-Human-CD28-Antikörper in jede Vertiefung geben. Nach vier bis sieben Tagen können Zellen für die weitere Analyse entnommen werden.