Eine Technik zur Kultivierung von Hippocampus-Neuronen von Mäusen

Nehmen Sie ein geerntetes Mausjunges Hippocampus in einem Puffer.

Schneide den Hippocampus in kleinere Fragmente und übertrage sie in eine konische Röhre.

Waschen Sie das Tuch mit Puffer. Sobald sich die Fragmente abgesetzt haben, entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie nun frischen Puffer und Trypsin hinzu.

Während der Inkubation verdaut Trypsin, ein proteolytisches Enzym, die extrazelluläre Matrix des Gewebes und lockert so die Neuronen des Hippocampus.

Waschen Sie das verdaute Gewebe mit Puffer.

Sobald sich die Fragmente abgesetzt haben, entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie frischen Puffer hinzu und pipettieren Sie das Gewebe wiederholt, um es mechanisch zu dissoziieren und eine einzellige Suspension zu erhalten.

Sobald sich das unverdaute Gewebe abgesetzt hat, wird die Zellsuspension auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser mit Wachsträgern in einer Kulturplatte mit Medium übertragen.

Die Zellen heften sich durch elektrostatische Wechselwirkungen an die Poly-L-Lysin-beschichteten Oberflächen.

Legen Sie nun die an Neuronen haftenden Deckgläser mit der Vorderseite nach unten in eine Schale, die kortikale gliale oder nicht-neuronale Zellen in serumfreien Medien enthält.

In Kultur verhindern Wachsträger den direkten Kontakt zwischen Neuronen und Gliazellen und schaffen eine Mikroumgebung, in der von Gliazellen sezernierte Faktoren das Überleben und die Reifung der Neuronen fördern.

Zu Beginn sezieren Sie sechs bis acht Hippocampi von postnatalen, einen Tag alten Welpen mit HBSS-Medium in einer Petrischale. Die Hippocampi mit einer Präparierschere in kleinere Stücke schneiden und aus der Schale in eine 15-Milliliter-Tube geben. Waschen Sie die Hippocampi zweimal mit 5 Millilitern HBSS und lassen Sie sie nach dem Waschen in 4,5 Millilitern HBSS.

Fügen Sie 0,5 Milliliter 2,5% Trypsin in 4,5 Milliliter HBSS hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, wobei Sie das Röhrchen alle 5 Minuten umdrehen. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Traube bilden. Verlängern Sie bei Bedarf den Aufschluss um weitere 5 Minuten.

Waschen Sie die Hippocampi dreimal pro Waschgang 5 Minuten lang mit HBSS. Nach dem Waschen 2 Milliliter HBSS hinzufügen und die Hippocampi mit einer Pasteur-Pipette 15 Mal auf und ab pipettieren. Zerreiben Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette 10 Mal und ruhen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang, bis alle Brocken am Boden fest sind. Wiederholen Sie die Verreibung mit den restlichen Stücken, bis die meisten von ihnen verschwunden sind.

Verwenden Sie dann eine 1-Milliliter-Pipettenspitze, um den Überstand mit den dissoziierten Neuronen vorsichtig auf die Plattschalen zu übertragen. Geben Sie es direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium und schütteln Sie die Platte vorsichtig. 2 bis 4 Stunden nach der Aussaat überprüfen Sie die Galvanikschalen mit einem Lichtmikroskop. Die Mehrzahl der Neuronen sollte sich an das Deckglas anheftet haben.

Drehen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette mit feiner Spitze mit der Wachspunktseite nach unten in die Gliazellen-Fütterungsschalen mit vorkonditioniertem neuronalem Kulturmedium um. Neuronen können bis zu einem Monat lang in den Gliazell-Feeder-Schalen wachsen. Füttern Sie die Neuronen alle sieben Tage mit 1 Milliliter frischem neuronalem Nährmedium.