Erzeugung einer primären Neuronenkultur mit niedriger Dichte aus gefrorenen embryonalen Neuronen

Beginnen Sie mit einem Kryofläschchen mit kryokonservierten embryonalen Neuronen und legen Sie es zum kontrollierten Auftauen in einen Heizblock.

Übertragen Sie anschließend die aufgetauten Neuronen in ein Röhrchen und verdünnen Sie sie tropfenweise mit einem neurobasalen Medium, um den osmotischen Druck auszugleichen und die Zelllyse zu verhindern.

Dadurch entsteht eine homogene Suspension mit gleichmäßig verteilten Neuronen.

Die verdünnte neuronale Suspension wird auf eine mit Poly-L-Lysin beschichtete Multiwell-Platte ausgesät, die ein mit Nährstoffen und Antibiotika angereichertes neurobasales Medium enthält.

Inkubieren, damit das positiv geladene Poly-L-Lysin über elektrostatische Wechselwirkungen mit den Neuronen interagieren kann, was deren Adhärenz erleichtert.

Versorgen Sie die Vertiefungen mit frischen neurobasalen Medien.

Inkubieren Sie die Zellen im selben Medium unter feuchten Bedingungen, um eine Verdunstung des Mediums zu verhindern.

Die embryonalen Neuronen nutzen die Nährstoffe und wachsen, indem sie neuronale Prozesse entwickeln und primäre Neuronen bilden.

Das neurobasale Medium erhält die primären Neuronen, die weit auseinander zu liegen scheinen, und erzeugt eine Primärkultur mit geringer Dichte und neuronalen Verbindungen.

Beginnen Sie damit, eine 96-Well-Mikroplatte mit 100 Mikrolitern Poly-L-Lysin pro Well zu beschichten. Inkubieren Sie die Platten anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Poly-L-Lysin-Lösung. Waschen Sie die Platten zweimal mit sterilisiertem Wasser und einmal mit zusatzfreiem frischem Nährmedium. Lege die Teller zum Trocknen heraus. Trockene Platten können eingewickelt und bis zu einem Monat bei 4 Grad Celsius gelagert werden.

Um mit der Zellaussaat zu beginnen, geben Sie 50 Mikroliter des Nährmediums in jede Vertiefung in der beschichteten Platte. Füllen Sie die peripheren Vertiefungen mit 200 Mikrolitern sterilisiertem Wasser und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nehmen Sie das Kryofläschchen des Neurons aus dem Flüssigstickstofftank und legen Sie es in einen 37 Grad Celsius heißen Block, um seinen Inhalt teilweise aufzutauen. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens mit einer 1-Milliliter-Pipette mit breiter Öffnung langsam tropfenweise in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das leere Kryofläschchen mit 1 Milliliter Nährmedium bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Spüllösung in das 50-Milliliter-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält.

Geben Sie dann 9 Milliliter des Raumtemperatur-Kulturmediums tropfenweise in das 50-Milliliter-Röhrchen, so dass das Volumen auf 11 Milliliter erhöht wird. Nachdem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt haben, überführen Sie die Zellsuspension in ein Reservoir. Geben Sie nun mit einer Mehrkanalpipette mit breiter Öffnung die Zellsuspension mit einer endgültigen Zählung von 1,0 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in die beschichtete 96-Well-Platte ab.

Inkubieren Sie die Neuronen 1 bis 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie dann das Kulturmedium durch 100 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium und inkubieren Sie erneut unter den gleichen Bedingungen.