Kultivierung fluoreszierender exzitatorischer Neuronen aus einem transgenen Maus-Welpengehirn

Nehmen wir das Gehirn eines transgenen Mäusewelpen.

Entfernen Sie das Kleinhirn und präparieren Sie das Gehirn. Trennen Sie das Kortiko-Hippocampus-Gewebe, das fluoreszierende Protein-exprimierende exzitatorische Neuronen enthält.

Übertragen Sie das Gewebe auf eine Kulturplatte mit Puffer.

Das Gewebe zerkleinern und in ein Röhrchen mit Papain geben.

Papain verdaut die extrazelluläre Matrix des Gewebes und lockert die Zellen, einschließlich der Neuronen.

Übertragen Sie das verdaute Gewebe in ein Röhrchen mit BSA-Proteinen, um die enzymatische Aktivität zu stoppen und Zellschäden zu verhindern.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch und setzen Sie Zellen frei.

Zentrifugieren und den Überstand, der Rückstände und Enzyme enthält, entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in neuronalen Medien mit niedriger Fluoreszenz und filtrieren Sie durch ein Zellsieb, wobei Zellaggregate entfernt werden.

Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch, um die fluoreszierenden Neuronen zu identifizieren und zu sortieren.

Übertragen Sie die sortierten Neuronen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge. Neuronen in neuronalen Medien resuspendieren.

Seed-Neuronen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern in einer Multi-Well-Platte. Neuronen haften an den beschichteten Oberflächen.

Neuronale Medien hinzufügen. Inkubieren, um das neuronale Wachstum zu erleichtern.

Präparieren Sie zuerst das Kleinhirn und trennen Sie die beiden Hemisphären. Trennen Sie dann vorsichtig den Hippocampus und die Hirnrinde von jeder Hemisphäre. Übertragen Sie das präparierte Gewebe in eine 35-Millimeter-Petrischale, die gekühlten Zellkulturpuffer enthält.

Übertragen Sie dann den präparierten Hippocampus und die Hirnrinde auf den Deckel einer weiteren 35-Millimeter-Petrischale. Mit der flachen Kante einer Skalpellklinge das Taschentuch vorsichtig kreuz und quer zerkleinern, bis nur noch kleine Stücke übrig sind.

Übertragen Sie anschließend das gehackte Gewebe mit einer kleinen Menge Papainlösung aus dem Deckel der Petrischale in das sterile Papainröhrchen. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für 25 Minuten. Nach der Papain-Inkubation werden das sterile Papain-Röhrchen und die sterilen BSA-Röhrchen in den Durchflussschrank überführt. Verwenden Sie dann eine 1-Milliliter-Pasteurpipette, um nur das Kortiko-Hippocampus-Gewebe aus der Papain-Sonde in die BSA-Sonde 1 zu übertragen.

Um große Gewebeklumpen aufzubrechen, zerreiben Sie das Gewebe mehrmals mit einer 1-Milliliter-Pasteurpipette. Anschließend zerkleinern Sie das Gewebe siebenmal mit einer Pasteur-Pipette mit feiner Spitze. Übertragen Sie nach 30 Sekunden 1 Milliliter der unteren Lösung und des Gewebes aus dem BSA-Röhrchen 1 in das BSA-Röhrchen 2.

Zerreiben Sie das Gewebe im BSA-Röhrchen 2 mehrmals mit einer Pasteurpipette mit feiner Spitze. Nach der Verreibung wird 1 Milliliter des unteren Gewebes in Lösung von BSA-Röhrchen 1 auf BSA-Röhrchen 3 übertragen. Zerreiben Sie das Gewebe im BSA-Röhrchen 3 mehrmals.

Nach der Verreibung die gesamte Lösung und das Gewebe aus den Röhrchen 2 und 3 in das BSA-Röhrchen 1 überführen. Noch 2 bis 3 Mal trituieren und bei 3.000 mal g 3 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus dem pelletierten Gewebe und resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette in 2 Millilitern vollständigem Hibernate A-Medium mit niedriger Fluoreszenz. Zerreiben Sie dann das Gewebe 20 Mal, um eine vollständige Resuspension der Gewebelösung zu gewährleisten.

Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 30-Mikrometer-Zellsieb in ein Probenröhrchen aus Polystyrol. Bereiten Sie Entnahmeröhrchen für die Zellsortierung vor, indem Sie 300 Mikroliter des kompletten Hibernate A-Mediums in die erforderliche Anzahl von Polypropylenröhrchen pipettieren.

Wählen Sie für jeden zu sortierenden Fluoreszenzzelltyp die passenden Anregungs- und Emissionsfilter. Stimulieren Sie venöses Protein mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und detektieren Sie das emittierte Licht durch einen Emissionsfiltersatz von 530 über 40.

Stimulieren Sie das TdTomato-Protein mit einer Anregungswellenlänge von 531 Nanometern und detektieren Sie das emittierte Licht durch einen Emissionsfiltersatz von 575 über 30. Für eine hohe Reinheit sortieren Sie hell markierte fluoreszierende Zellen. Nach der Zellsortierung werden die gesammelten Zellen in 2-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt. Zentrifugieren Sie dann die Zellen 3 Minuten lang bei 3.000 mal g, um ein Zellpellet zu bilden.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in der erforderlichen Menge an vorgewärmtem NBA-Medium, um eine Zelldichte von 1.000 Zellen pro Mikroliter zu erreichen. Um das Vorhandensein von dissoziierten Zellen zu bestätigen, überprüfen Sie die Zelllösung unter einem Mikroskop mit einer 4x- oder einer 10x-Objektivlinse. Vor dem Plattieren der Zellen 2 bis 3 Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten.

Pipettieren Sie nach dem Vortexen schnell 10 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jedes Deckglases. Füttern Sie die Zellen nach einer Stunde mit 500 Mikrolitern vorgewärmtem NBA-Komplettmedium und kehren Sie bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück.